陳鑫，胡玥玥，徐鴻毅，王曉燕，鄧鍇

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重組人PLCζ蛋白在昆蟲細(xì)胞/桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)的表達(dá)、純化及活性測(cè)定

陳鑫1，胡玥玥1，徐鴻毅1，王曉燕2，鄧鍇1

1 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)中心，湖北 十堰 442000 2 湖北醫(yī)藥學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 十堰 442000

PLCζ是PLC家族的一種新型同工酶，在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞激活中起著極其重要的作用。近年來，體外大量表達(dá)和純化有活性的PLCζ蛋白用于結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究一直未能獲得成功。本研究首次在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)和純化重組人PLCζ蛋白，首先將人PLCζ基因克隆至pFastBac-HTA質(zhì)粒構(gòu)建重組載體，轉(zhuǎn)化DH10Bac發(fā)生位點(diǎn)特異性轉(zhuǎn)座，經(jīng)抗性和藍(lán)白斑篩選，獲得重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-PLCζ；在脂質(zhì)體介導(dǎo)下將穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞產(chǎn)生重組病毒，擴(kuò)增病毒感染Sf9昆蟲細(xì)胞進(jìn)行蛋白表達(dá)；利用Ni2+親和柱及分子篩來純化蛋白，并通過考馬斯亮藍(lán)染色、Western blotting及飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)蛋白進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行酶活性測(cè)定。結(jié)果顯示重組蛋白在Sf9昆蟲細(xì)胞感染桿狀病毒后72 h達(dá)到峰值并以分泌形式表達(dá)在細(xì)胞培養(yǎng)基中，Ni2+親和柱及分子篩純化后的重組蛋白經(jīng)Western blotting及電離飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定為PLCζ蛋白，酶活性可達(dá)326.8 U/mL。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為重組人PLCζ蛋白大規(guī)模生產(chǎn)和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究提供了可參考利用的技術(shù)。

PLCζ蛋白，昆蟲細(xì)胞，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)，純化，鑒定

磷脂酶C-zeta (Phospholipase C-zeta，PLCζ)是磷脂酶C家族的一種新型同工酶，是哺乳動(dòng)物精子激活卵母細(xì)胞重要的生理性刺激因子[1]。在哺乳動(dòng)物受精過程中，PLCζ蛋白作為“精子因子”被釋放入卵母細(xì)胞中，水解磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸脂 (Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate，PIP2)產(chǎn)生第二信使1,4,5-三磷酸肌醇(Inositol-1,4,5- triphosphate，IP3)，誘導(dǎo)卵母細(xì)胞內(nèi)Ca2+周期性增加，從而使處于停滯期的卵母細(xì)胞恢復(fù)第二次減數(shù)分裂并啟動(dòng)胚胎發(fā)育[2-3]。精子中PLCζ蛋白水平降低或缺失與卵母細(xì)胞激活缺陷型男性不育密切相關(guān)，人工輔助卵母細(xì)胞激活是解決此類男性不育的重要方法[4-5]。目前常用的人工輔助卵母細(xì)胞激活方法是機(jī)械刺激及化學(xué)激活，考慮到這些外界操作影響卵母細(xì)胞質(zhì)量以及化學(xué)物質(zhì)對(duì)胚胎的潛在危害，人工輔助卵母細(xì)胞激活技術(shù)未能廣泛開展[6-7]。PLCζ蛋白在輔助卵母細(xì)胞激活中有著較大的應(yīng)用潛能，使用純化的具有活性的重組人PLCζ蛋白可能是一種更安全有效的治療卵母細(xì)胞激活缺陷型男性不育癥的潛在方法[8-10]。

體外表達(dá)和純化有活性的重組人PLCζ蛋白用以生物學(xué)應(yīng)用的研究一直備受關(guān)注，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)重組人PLCζ蛋白的體外表達(dá)進(jìn)行了廣泛的探索，Nomikos等嘗試用含組氨酸標(biāo)簽的質(zhì)粒載體通過大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)純化重組蛋白，發(fā)現(xiàn)原核系統(tǒng)表達(dá)量極低，將這些蛋白顯微注射到小鼠卵母細(xì)胞中時(shí)不能引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+振蕩啟動(dòng)胚胎發(fā)育[11]。與大腸桿菌等原核表達(dá)系統(tǒng)相比，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在增加重組蛋白的可溶性、蛋白質(zhì)翻譯后加工修飾方面具有天然優(yōu)勢(shì)，能更好地保持蛋白的生物活性[12]。為了大量表達(dá)和純化出有活性的重組人PLCζ蛋白，進(jìn)一步探索精卵融合時(shí)其蛋白與受體之間相互作用以及其作為輔助卵母細(xì)胞激活生物制劑的可行性，本研究從質(zhì)粒構(gòu)建開始，利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功地表達(dá)并純化出有活性的重組人PLCζ蛋白，為接下來對(duì)PLCζ蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系及PLCζ生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

草地貪夜蛾Sf9昆蟲細(xì)胞、桿狀病毒Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)(重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac HTA、DH10Bac感受態(tài)大腸桿菌、Cellfectin Ⅱ試劑)、SF-900II SFM培養(yǎng)基、Grace’s Insect Medium、ECL顯色試劑盒等購自Invitrogen公司；DNA 高保真聚合酶、限制性內(nèi)切酶Ⅰ、dⅢ等購自寶生物工程(大連) 有限公司；對(duì)硝基磷酸膽堿(p-nitrophehylphosphoryl choline，p-NPPC)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、考馬斯亮藍(lán)R-250、甲基纖維素等購自Sigma公司；His GraviTrap親和層析柱購自GE Healthcare公司；兔源抗人PLCζ蛋白單克隆抗體和HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體均購自Abcam公司；PureLink HiPure Plasmid Miniprep kit購自QIAGEN公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建

檢索GenBank數(shù)據(jù)庫獲取人PLCζ基因(登錄號(hào)：NM_033123) 的mRNA序列，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；合成的全長(zhǎng)人PLCζ編碼基因?yàn)? 841bp，其中5′端插入Ⅰ酶切位點(diǎn)，3′端插入dⅢ酶切位點(diǎn)。將合成的PLCζ目的片段克隆至經(jīng)Ⅰ、dⅢ雙酶切后的pFastBac HTA載體中，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac-PLCζ。PLCζ特異性引物參照Primer Premier 5擴(kuò)增全長(zhǎng)設(shè)計(jì)，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

1.3 重組桿狀病毒穿梭載體的制備

按照Invitrogen公司的Bac-to-Bac Baculovirus Expression System使用說明將pFastBac-PLCζ構(gòu)建體轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，用未插入外源基因的pFastBac HTA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞作為陰性對(duì)照[13]。取50 μL菌液涂布含有50 μg/mL卡那霉素、10 μg/mL四環(huán)素、 7 μg/mL慶大霉素、100 μg/mL X-gal和40 μg/mL IPTG的LB瓊脂平板，置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，48 h后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。隨機(jī)挑取白色單克隆菌落接種于LB液體培養(yǎng)基37 ℃過夜培養(yǎng)。使用PureLink Hipure Plasmid Miniprep kit提取重組桿粒并用PLCζ特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，鑒定正確的重組桿粒命名為Bacmid-PLCζ。

表1 載體構(gòu)建及鑒定所用的引物

1.4 重組桿狀病毒的制備與鑒定

按照Invitrogen公司的CellfectinⅡ陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑操作說明轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Sf9昆蟲細(xì)胞，5 h后更換新鮮的完全培養(yǎng)基，置于27 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72?96 h。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時(shí)離心收集上清液即為P1代重組病毒，將P1代重組桿狀病毒按照感染復(fù)數(shù)(MOI) 為0.1接種對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的Sf9細(xì)胞進(jìn)行重組病毒的增殖與傳代，得到P2代重組桿狀病毒。按照相同的方法將病毒傳至P3代，采用改良的病毒噬斑法即來測(cè)定桿狀病毒儲(chǔ)液的滴度[14]，即用甲基纖維素代替?zhèn)鹘y(tǒng)的瓊脂糖覆蓋病毒感染后的細(xì)胞，之后進(jìn)行病毒噬斑的檢測(cè)。

1.5 重組PLCζ蛋白的表達(dá)、純化及鑒定

將P3代重組桿狀病毒以MOI=3的比例感染處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期、密度為2×106/mL的Sf9昆蟲細(xì)胞，100 r/min、27 ℃培養(yǎng)96 h。收獲細(xì)胞混合物，3 800 r/min離心40 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后經(jīng)切向流超濾膜包VIVAFLOW 200濃縮至50 mL，采用Ni-NTA親和層析柱純化上清液，以含250 mmol/L咪唑的變性緩沖液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液后經(jīng)分子篩進(jìn)一步純化。純化的PLCζ蛋白樣品經(jīng)煮沸變性處理后用兩塊8%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE。其中一塊凝膠用考馬斯亮藍(lán)快速染色液染色，隨后用脫色液進(jìn)行脫色，以鑒定目的蛋白的分子質(zhì)量，同時(shí)切膠后經(jīng)基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。另一塊凝膠經(jīng)半干法轉(zhuǎn)印PVDF膜，以兔源的抗重組人PLCζ蛋白抗體作為一抗，以HRP標(biāo)記的山羊抗兔作為二抗進(jìn)行常規(guī)Western blotting鑒定。

1.6 重組人PLCζ蛋白的活性檢測(cè)

PLC可水解p-NPPC生成黃色物質(zhì)對(duì)硝基苯酚，對(duì)硝基苯酚在410 nm處有最大吸光度值，故可以通過酶標(biāo)儀測(cè)定反應(yīng)前后在410 nm處吸光度值的變化，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量計(jì)算重組人PLCζ蛋白的活性[15]。反應(yīng)混合物中含0.25 mol/L Tris-HCl (pH 7.2) 緩沖液，1 mmol/L的ZnCl2，60%的山梨醇(/)，10 mmol/L的p-NPPC。取20 μL 0.5 μg/mL的PLCζ蛋白樣品溶液加入到200 μL反應(yīng)混合物中混勻，37 ℃水浴反應(yīng)30 min，加入0.5 mol/L的NaOH 200 μL終止酶促反應(yīng)后測(cè)定在410 nm波長(zhǎng)處的吸收值。酶活單位的定義：pH 7.2、溫度為37 ℃條件下，每分鐘水解p-NPPC產(chǎn)生1 nmol對(duì)硝基苯酚所需要的酶量為1個(gè)酶活力單位(U)。

2 結(jié)果與分析

2.1 pFast-Bac-HTA-PLCζ重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的鑒定

將重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFast-Bac-HTA-PLCζ用Ⅰ和dⅢ雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖電泳，結(jié)果(圖1) 顯示重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后有2條特異性條帶，其中一條為PLCζ基因約為1 800 bp，另一條為載體pFast-Bac-HTA片段約為4 700 bp，均與目的基因大小和載體質(zhì)粒片段相符，表明載體構(gòu)建成功，結(jié)果見圖1。

圖1 重組質(zhì)粒pFast-Bac-HTA-PLCζ雙酶切產(chǎn)物

2.2 Bacmid-PLCζ構(gòu)建及鑒定

提取重組桿粒，以PLCζ-for/PLCζ-rev為引物對(duì)重組桿粒進(jìn)行PCR鑒定，取出5 μL產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳后，在約1 840 bp處有一特異性條帶，與預(yù)期片段大小相符，結(jié)果見圖2。插入Bacmid的PLCζ基因經(jīng)測(cè)序表明序列正確，可用于制備重組桿狀病毒顆粒。

2.3 重組Bacmid-PLCζ轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞及病毒擴(kuò)增

將重組桿粒Bacmid-PLCζ用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，27 ℃培養(yǎng)72 h后細(xì)胞有明顯的病毒感染跡象，主要表現(xiàn)為細(xì)胞生長(zhǎng)停滯，胞體脹大變圓，胞核明顯，部分細(xì)胞裂解，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞未出現(xiàn)此現(xiàn)象。離心收集上清，標(biāo)記為PLCζ P1代病毒，收獲病毒液連續(xù)傳代后收取P3代桿狀病毒，利用甲基纖維素改良的病毒噬斑法測(cè)定P3代病毒滴度為5.2×108PFU/mL (圖3)。

圖2 重組桿粒Bacmid-PLCζ的PCR鑒定

圖3 甲基纖維素噬斑法測(cè)定病毒滴度結(jié)果分析

2.4 PLCζ重組蛋白的表達(dá)及鑒定

重組Bacmid-PLCζ病毒感染Sf9昆蟲細(xì)胞，72 h后離心收集細(xì)胞培養(yǎng)基，濃縮親和層析純化后的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離，考馬斯亮藍(lán)染色顯示相對(duì)分子質(zhì)量約為70 kDa的條帶，其大小與重組人PLCζ蛋白的理論相對(duì)分子質(zhì)量相符，該條帶經(jīng)飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定為重組人PLCζ蛋白(圖4)，其中Mascot得分為151，蛋白序列覆蓋率為50%。用抗人PLCζ蛋白單克隆抗體進(jìn)行Western blotting分析，成像結(jié)果顯示一條相對(duì)分子質(zhì)量約為70 kDa的特異性條帶，與人PLCζ融合蛋白的理論分子質(zhì)量相符 (圖5)。

圖4 重組人PLCζ蛋白的肽指紋圖譜鑒定結(jié)果

2.5 重組人PLCζ蛋白的活性測(cè)定

重組人PLCζ蛋白可水解p-NPPC生成對(duì)硝基苯酚，其在410 nm處有最大吸收峰，此吸光值可反映PLCζ水解p-NPPC產(chǎn)生對(duì)硝基苯酚的量。將濃度為0.025 g/L的對(duì)硝基苯酚溶液梯度稀釋后測(cè)定在410 nm處的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的回歸方程為：=94.51?0.043，2=0.999 1，y為對(duì)硝基苯酚的濃度(nmol/mL)，為不同濃度對(duì)硝基苯酚在410 nm處吸光值。酶活力計(jì)算公式為：

PLCζ酶活力U (U/mL)=(94.51?0.053)總/30·酶

注：為反應(yīng)后410，總為反應(yīng)體系總體積(mL)，酶為加入重組人PLCζ蛋白體積(mL)。

圖5 重組人PLCζ蛋白的SDS-PAGE和Western blotting鑒定

經(jīng)過優(yōu)化表達(dá)、純化條件，最終獲得重組人PLCζ蛋白酶活力可達(dá)到326.8 U/mL。

3 討論

PLCζ蛋白在卵母細(xì)胞活化中發(fā)揮著重要作用，其異常形式或含量減低可能是某些精子激活卵母細(xì)胞失敗型男性不育的根本原因[16-18]。Kouchi等純化出有活性的重組小鼠PLCζ蛋白并將其注射入小鼠卵母細(xì)胞，可觀察到類似于精子顯微注射時(shí)引發(fā)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+振蕩，啟動(dòng)小鼠胚胎發(fā)育[19]。雖然這些研究意味著PLCζ在卵母細(xì)胞激活缺陷型男性不育治療中的應(yīng)用潛力，但是關(guān)于有活性的人PLCζ重組蛋白的體外表達(dá)及純化一直沒有取得大的進(jìn)展。為更好地分析PLCζ的結(jié)構(gòu)及功能，探究其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，體外表達(dá)和純化有活性的人PLCζ重組蛋白顯得尤為重要。

昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是繼大腸桿菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)后的另一個(gè)高效的蛋白表達(dá)系統(tǒng)。其系統(tǒng)適當(dāng)?shù)姆肿影閭H和翻譯后修飾加工體系使其表達(dá)的蛋白更加接近體內(nèi)天然形式同時(shí)具有較高的生物學(xué)活性[20-21]。為了得到具有生物學(xué)活性的PLCζ蛋白，分析其酶學(xué)分子特性以及在激活卵母細(xì)胞時(shí)與其他分子之間的相互作用，進(jìn)一步探究其作為人工輔助卵母細(xì)胞激活生物制劑的可行性，本研究利用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)并分離純化重組人PLCζ蛋白。

為了便于蛋白純化，本研究中我們將人PLCζ基因克隆至含有6×His標(biāo)簽及AcTEVTM白酶剪切位點(diǎn)的pFastBac HTA質(zhì)粒中，所表達(dá)蛋白經(jīng)親和層析純化后，重組PLCζ蛋白純度高，無雜蛋白污染。擴(kuò)增桿狀病毒顆粒后認(rèn)MOI=5感染Sf9昆蟲細(xì)胞，培養(yǎng)72 h后PLCζ蛋白以胞外分泌的形式表達(dá)，可以從無血清培養(yǎng)基中分離純化出靶蛋白。本研究中重組桿狀病毒經(jīng)過3次擴(kuò)增病毒后滴度經(jīng)測(cè)定為5.2×108PFU/mL，滴度不夠高在一定程度上可能會(huì)影響重組蛋白的大批量純化?？紤]到影響病毒感染效率的因素有目的基因片段的大小，重組Bacmid DNA的轉(zhuǎn)染效率、病毒存放時(shí)間、保存條件等，本實(shí)驗(yàn)中采用新鮮的病毒進(jìn)行Sf9昆蟲細(xì)胞的感染，并加入了終濃度2%的胎牛血清避光存放于4 ℃，病毒降解可能不是影響桿狀病毒毒力的主要因素，而采用有效的方法提高轉(zhuǎn)染效率是提高病毒滴度的關(guān)鍵。有研究表明通過多次傳代可以提高病毒毒力，但應(yīng)當(dāng)注意桿狀病毒在細(xì)胞中多次傳代后可能引起基因組的改變，出現(xiàn)多角體表型變化，導(dǎo)致蛋白表達(dá)水平降低[22]。為了減少重組桿狀病毒在傳代后存在突變導(dǎo)致蛋白表達(dá)水平降低的可能，通過擴(kuò)大轉(zhuǎn)染體積、離心濃縮病毒顆粒等方法來獲取低代數(shù)、高滴度的重組病毒是后續(xù)研究中需要實(shí)現(xiàn)的目標(biāo)。影響重組蛋白表達(dá)的因素除了表達(dá)載體選擇和目的基因本身大小、重組病毒感染效率之外還取決于宿主細(xì)胞狀態(tài)及培養(yǎng)條件和蛋白收獲時(shí)間[23-24]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)宿主細(xì)胞狀態(tài)對(duì)目的蛋白的產(chǎn)量至關(guān)重要，感染前應(yīng)選擇傳代次數(shù)少、細(xì)胞存活率高于95%、無異常形態(tài)的健康對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行重組病毒接種；宿主細(xì)胞狀態(tài)不佳時(shí)無論是通過增加病毒接種量、延長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間還是增加宿主細(xì)胞數(shù)量均不能提高蛋白表達(dá)量?？紤]到表達(dá)的重組蛋白會(huì)被細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)自身蛋白酶所降解，我們選擇在感染72 h作為收獲PLCζ蛋白的最佳時(shí)間點(diǎn)。為了把目的蛋白從細(xì)胞培養(yǎng)基中分離出來，同時(shí)還要保持其生物學(xué)活性，蛋白純化過程中盡量在低溫環(huán)境中進(jìn)行[25]。收集感染病毒后的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基后，可以加入蛋白酶抑制劑以防止目的蛋白降解，利用重組蛋白上所帶的His標(biāo)簽與Ni2+親和層析達(dá)到分離純化目的蛋白與雜蛋白，最后經(jīng)高濃度咪唑洗脫得到目的蛋白?？捡R斯亮藍(lán)染色及Western blotting檢測(cè)蛋白大小為68 kDa左右，與人PLCζ蛋白的理論分子大小一致，該蛋白經(jīng)電離飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定為PLCζ蛋白，經(jīng)酶學(xué)測(cè)定顯示有生物學(xué)活性，說明本方法可成功獲得有活性的重組人PLCζ蛋白。

PLCζ蛋白是PLC家族的最新成員，目前關(guān)于人PLCζ蛋白結(jié)構(gòu)及功能的研究鮮見報(bào)道。本研究利用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞真核表達(dá)系統(tǒng)獲得了在結(jié)構(gòu)及功能上都更接近天然蛋白特性的重組人PLCζ蛋白，這為下一步進(jìn)行人PLCζ蛋白晶體結(jié)構(gòu)解析的生物學(xué)研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，也為加深對(duì)PLCζ在卵母細(xì)胞激活缺陷型男性不育診斷和治療上的探索提供了可能。

[1] Saunders CM, Larman MG, Parrington J, et al. PLC zeta: a sperm-specific trigger of Ca2+oscillations in eggs and embryo development. Development, 2002, 129(15): 3533–3544.

[2] Swann K, Saunders CM, Rogers NT, et al. PLCζ(zeta): a sperm protein that triggers Ca2+oscillations and egg activation in mammals. Semin Cell Dev Biol, 2006, 17(2): 264–273.

[3] Xu HY, Deng K, Luo QB, et al. High Serum FSH is associated with brown oocyte formation and a lower pregnacy rate in human IVF parctice. Cell Physiol Biochem, 2016, 39(2): 677–684.

[4] Nomikos M, Elgmati K, Theodoridou M, et al. Male infertility-linked point mutation disrupts the Ca2+oscillation-inducing and PIP2, hydrolysis activity of sperm PLCζ. Biochem J, 2011, 434(2): 211–217.

[5] Heytens E, Parrington J, Coward K, et al. Reduced amounts and abnormal forms of phospholipase C zeta (PLCζ) in spermatozoa from infertile men. Hum Reprod, 2009, 24(10): 2417–2428.

[6] Ramadan WM, Kashir J, Jones C, et al. Oocyte activation and phospholipase C zeta (PLCζ): diagnostic and therapeutic implications for assisted reproductive technology. Cell Commun Signal, 2012, 10(1): 12.

[7] Ozil JP, Banrezes B, Tóth S, et al. Ca2+oscillatory pattern in fertilized mouse eggs affects gene expression and development to term. Dev Biol, 2006, 300(2): 534–544.

[8] Tavalaee M, Nasr-Esfahani MH. Expression profile of,, and-in association with fertilization potential, embryo development, and pregnancy outcomes in globozoospermic candidates for intra-cytoplasmic sperm injection and artificial oocyte activation. Andrology, 2016, 4(5): 850–856.

[9] Amdani SN, Yeste M, Jones C, et al. Phospholipase C zeta (PLCζ) and male infertility: clinical update and topical developments. Adv Biol Regul, 2016, 61: 58–67.

[10] Yoon SY, Eum JH, Lee JE, et al. Recombinant human phospholipase C zeta 1 induces intracellular calcium oscillations and oocyte activation in mouse and human oocytes. Hum Reprod, 2012, 27(6): 1768–1780.

[11] Nomikos M, Yu YS, Elgmati K, et al. Phospholipase Cζ rescues failed oocyte activation in a prototype of male factor infertility. Fertil Steril, 2013, 99(1): 76–85.

[12] Li ZH, Wang QJ. Expression, purification and characterization of catalytic domain of protein kinase D1 in baculovirus-insect cell expression system. Chin J Biotech, 2014, 30(8): 1291?1298 (in Chinese). 李志紅, Wang QJ. 蛋白激酶D1催化結(jié)構(gòu)域在昆蟲細(xì)胞/桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)的表達(dá)、純化和活性測(cè)定. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(8): 1291?1298.

[13] Luckow VA, Lee SC, Barry GF, et al. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in. J Virol, 1993, 67(8): 4566–4579.

[14] Baer A, Kehn-Hall K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. J Vis Exp, 2014, (93): e52065.

[15] Flieger A, Gong SM, Faigle M, et al. Critical evaluation of p-nitrophenylphosphorylcholine (p-NPPC) as artificial substrate for the detection of phospholipase C. Enzyme Microb Technol, 2000, 26(5/6): 451–458.

[16] Kashir J, Heindryckx B, Jones C, et al. Oocyte activation, phospholipase C zeta and human infertility. Hum Reprod Update, 2010, 16(6): 690–703.

[17] Parrington J. Does a soluble sperm factor trigger calcium release in the egg at fertilization? J Androl, 2001, 22(1): 1–11.

[18] Rogers NT, Halet G, Piao Y, et al. The absence of a Ca2+signal during mouse egg activation can affect parthenogenetic preimplantation development, gene expression patterns, and blastocyst quality. Reproduction, 2006, 132(1): 45–57.

[19] Kouchi Z, Fukami K, Shikano T, et al. Recombinant phospholipase Czeta has high Ca2+sensitivity and induces Ca2+oscillations in mouse eggs. J Biol Chem, 2004, 279(11): 10408–10412.

[20] Lin SY, Chen GY, Hu YC. Recent patents on the baculovirus systems. Recent Pat Biotechnol, 2011, 5(1): 1–11.

[21] Zhang ZG, Jing Y, Barford D. Recombinant expression and reconstitution of multiprotein complexes by the USER cloning method in the insect cell-baculovirus expression system. Methods, 2016, 95: 13–25.

[22] Kool M, Ahrens CH, Vlak JM, et al. Replication of baculovirus DNA. J Gen Virol, 1995, 76(9): 2103–2118.

[23] Ren YY, Chen D, Guo YZ, et al. Expression of human retinol-binding protein 4 in insect baculovirus system and preparation of its polyclonal antibody. Chin J Biotech, 2013, 29(7): 974?985 (in Chinese). 任玉瑩, 陳丹, 郭玉爭(zhēng), 等. 人視黃醇結(jié)合蛋白4在桿狀病毒系統(tǒng)中的表達(dá)及其多克隆抗體制備. 生物工程學(xué)報(bào), 2013, 29(7): 974?985.

[24] Jarvis DL. Developing baculovirus-insect cell expression systems for humanized recombinant glycoprotein production. Virology, 2003, 310(1): 1–7.

[25] Wingfield PT. Overview of the purification of recombinant proteins. Curr Protoc Protein Sci, 2015, 80(6): 1–35.

Expression, purification and characterization of recombinant PLCζ protein in baculovirus-insect cell expression system

Xin Chen1, Yueyue Hu1, Hongyi Xu1, Xiaoyan Wang2, and Kai Deng1

1Reproductive Medicine Center, Renmin Hospital, Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, Hubei, China 2 School of Basic Medical Sciences, Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, Hubei, China

PLCζ is a new isoenzyme of the PLC family which plays an important role in activating mammalian oocytes. In recent years, large-scale expression and purification of active PLCζ proteinfor structural biology research has not been successful. In this study, the recombinant human PLCζ protein was expressed and purified in the baculovirus expression system. First, the full length of human PLCζ gene was cloned into the pFastBac-HTA plasmid to form the recombinant donor plasmid that was further transformed into DH10Baccells to construct the recombined bacmid by the site-specific transposition that was screened by resistance and blue-white spots. Then the bacmid was transfected to Sf9 insect cells via cellfectin to package the recombinant baculovirus. After the amplification of the recombinant baculovirous, the recombinant protein was expressed from the cells transduced by the recombinant baculovirus and was purified by Ni-NTA resin. Purified protein was identified by Western blotting and time-of-flight mass spectrometry and the enzyme activity was determined. The results showed that the recombinant PLCζ protein in the Sf9 cells was achieved at 72 hours after baculovirus infection and expressed in secreted form in cell culture medium. The recombinant protein purified by Ni2+affinity column was identified as PLCζ by Western blotting and ionization time-of-flight mass spectrometry and the enzyme activity was up to 326.8 U/mL. The experimental results provide a reference for the large-scale production and biological application of recombinant human PLCζ protein.

PLCζ protein, insect cell, baculovirus expression system, expression, purification, identification

December 6, 2018;

February 18, 2019

National Natural Science Foundation of China (No. 81401200), Natural Science Foundation of Hubei Province of China (Nos. 2018CFB219, 2013CFB479), Research Project of Hubei Provincial Department of Education (Nos. B2015478, B2015493).

Xiaoyan Wang. Tel: +86-719-8875302; E-mail: xywangdk@163.com

Kai Deng. Tel: +86-719-8637123; E-mail: dkeanig@163.com

國家自然科學(xué)基金 (No. 81401200)，湖北省自然科學(xué)基金 (Nos. 2018CFB219，2013CFB479)，湖北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目 (Nos. B2015478，B2015493) 資助。

10.13345/j.cjb.180507

陳鑫, 胡玥玥, 徐鴻毅, 等. 重組人PLCζ蛋白在昆蟲細(xì)胞/桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)的表達(dá)、純化及活性測(cè)定. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(6): 1135–1142.

Chen X, Hu YY, Xu HY, et al. Expression, purification and characterization of recombinant PLCζ protein in baculovirus-insect cell expression system. Chin J Biotech, 2019, 35(6): 1135–1142.

(本文責(zé)編 陳宏宇)