胡嬋 曹智 吳煜昊 張國龍 王秀麗

(上海市皮膚病醫(yī)院光醫(yī)學(xué)治療科，上海 200433)

健康宿主抵御白念珠菌的第1道防線是依賴巨噬細胞和中性粒細胞等吞噬細胞的吞噬作用。吞噬細胞通過呼吸爆發(fā)產(chǎn)生一系列活性氧(ROS)，包括過氧化氫(H2O2)等[1]，誘導(dǎo)白念珠菌發(fā)生程序性細胞死亡[2]；相反，白念珠菌也可通過增加抗氧化基因表達量、誘導(dǎo)菌絲形成、激活相應(yīng)的氧化應(yīng)激通路等機制來抵御ROS的氧化損傷。病原菌耐受ROS等氧化物質(zhì)能力的增強可能會導(dǎo)致其形成免疫耐受，使感染難以控制。近年來，對于白念珠菌如何逃避氧化應(yīng)激損傷得到了廣泛的關(guān)注和研究。

1 ROS對白念珠菌蛋白質(zhì)、脂類和核酸的損傷效應(yīng)

ROS與蛋白質(zhì)、脂類和核酸相互作用[3]，對病原體造成不可逆的損害。ROS引起的DNA損傷包括化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變、單雙鏈的斷裂與交叉連接。氧自由基反應(yīng)引起的脂質(zhì)過氧化可導(dǎo)致細胞膜的損傷。ROS與蛋白質(zhì)的相互反應(yīng)導(dǎo)致蛋白質(zhì)交聯(lián)、肽鏈氧化以及氨基酸側(cè)鏈可逆或不可逆的氧化。另外ROS在吞噬細胞內(nèi)還可以轉(zhuǎn)化成其他的毒性化合物[4]。如H2O2能在髓過氧化物酶(MPO)的作用下與氯離子(Cl-)反應(yīng)形成次氯酸(HOCl)。此外，由一氧化氮合酶(iNOS)誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化氮自由基與超氧化物相互作用，產(chǎn)生劇毒的過氧亞硝酸鹽(ONOO)[5]。

2 白念珠菌對ROS的反應(yīng)

2.1 白念珠菌對ROS的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答

ROS可誘導(dǎo)真核生物編碼mRNAs，合成抗氧化應(yīng)激蛋白和修復(fù)蛋白。當(dāng)暴露于H2O2時，白念珠菌可以誘導(dǎo)抗氧化基因[6-7]，包括編碼過氧化氫酶(Cat1)，谷胱甘肽過氧化物酶(Gpx)和超氧化物歧化酶(Sod)的基因，也包括編碼谷胱甘肽/谷氧還蛋白(Gsh1，Trr1)的基因和硫氧還蛋白系統(tǒng)(Tsa1，Trx1，Trr1)基因，它們在修復(fù)氧化損傷、蛋白折疊與硫代謝中起著至關(guān)重要的作用。

2.2 高滲應(yīng)激可抑制白念珠菌對ROS的反應(yīng)

除ROS以外，吞噬細胞也通過產(chǎn)生陽離子K+以及超氧陰離子等高滲狀態(tài)來抵抗白念珠菌[5,8-9]，高滲應(yīng)激還可抑制白念珠菌的氧化應(yīng)激反應(yīng)，這種現(xiàn)象被稱為“應(yīng)激通路干擾(stress pathway interference)”[10]。在H2O2單獨作用下，白念珠菌的抗氧化關(guān)鍵基因，如CAT1和TRR1表達明顯增加，然而如果有H2O2和高滲應(yīng)激雙重作用時，以上基因則不能正常表達。

2.3 白念珠菌特有的適應(yīng)機制——細胞外抗氧化酶

白念珠菌對ROS的耐受性可能與SOD家族有關(guān)，白念珠菌在細胞表面表達SOD等抗氧化酶，其中包括分布在不同部位的6種SOD酶。Sod1-3是細胞內(nèi)酶，Sod4-6是抗糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定于細胞壁的相關(guān)酶。白念珠菌被吞噬后誘導(dǎo)產(chǎn)生含有銅或鋅的Sod，可抵抗巨噬細胞的殺傷作用[11]。

2.4 ROS對白念珠菌形態(tài)的改變

在吞噬作用后，白念珠菌可以從出芽態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫z態(tài)，以逃避巨噬細胞和中性粒細胞對其的氧化損傷，菌絲可以穿透吞噬體膜[12]，甚至可以殺傷吞噬細胞[13]。ROS可以誘導(dǎo)精氨酸合成基因表達增加，對白念珠菌被吞噬后的菌絲形成至關(guān)重要[14]。某些對ROS異常敏感的突變白念珠菌被吞噬后，不能形成菌絲，無法抵御吞噬細胞的殺傷作用。

3 ROS對白念珠菌信號通路的影響

目前已知ROS可激活白念珠菌的3種信號通路：包括Cap1通路、Hog-MAPK通路和Rad53(DNA損傷檢驗點)通路。

3.1 Cap1通路

Cap1與釀酒酵母的Yap1和粟酒裂殖酵母的Pap1高度同源，Yap1和Pap1在氧化應(yīng)激和多藥耐藥中的作用是非常明確的[14-15]。白念珠菌的cap1⊿菌株也被證實對ROS和藥物非常敏感[16-17]。CAP1的下游基因包括關(guān)鍵的抗氧化基因TRX1和耐藥基因MDR1[18]。

Cap1的調(diào)控機制 與釀酒酵母Yap1類似，H2O2可以使白念珠菌的Cap1在細胞核內(nèi)迅速累積[17,19]。在非應(yīng)激條件下，位于轉(zhuǎn)錄因子C段的Crm1核輸出因子，可以使Cap1穿梭于細胞質(zhì)和細胞核之間。在H2O2的作用下，Cap1結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而阻止Cap1和Crm1的相互作用，Cap1在核內(nèi)大量積聚、磷酸化，并誘導(dǎo)抗氧化基因的表達。Cap1的激活可以被硫氧還蛋白(Trx1、Trx2)抵消[20]。另外，白念珠菌的Cap1氧化過程需要Gpx3(一種類似谷胱甘肽過氧化物酶的酶)[19]；Gpx3介導(dǎo)的Cap1氧化反應(yīng)還需要Ybp1蛋白，Ybp1與Cap1相結(jié)合形成復(fù)合物[19,21](見圖1)。

Cap1對毒力的影響 缺失CAP1或其調(diào)控因子GPX3和YBP1基因，會使白念珠菌的毒力有所減弱。CAP1、GPX3或YBP1突變株被吞噬后無法形成菌絲[19]。CAP1可以誘導(dǎo)TRX1的表達，對于白念珠菌的生存至關(guān)重要[20,22]。

3.2 Hog-MAPK通路

Hog-MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路廣泛存在于真核細胞內(nèi)，可以提高細胞適應(yīng)周圍環(huán)境的能力[23]。它們是由保守的三級激酶級聯(lián)系統(tǒng)構(gòu)成：MAPKKK(Ssk2)-MAPKK(Pbs2)-和MAPK(Hog1)。暴露于H2O2的白念珠菌，上游信號(Sln1等)促使磷酸基團由MAPKKK向MAPK逐步傳遞，Hog通路被激活，最后磷酸化的Hog1發(fā)生核轉(zhuǎn)位進入細胞核內(nèi)，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，從而使細胞可以耐受氧化應(yīng)激壓力[7](見圖2)。缺乏Hog1的白念珠菌對ROS敏感性增加，表明Hog1激活是白念珠菌氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要組成部分[24-25]，而且只有相對高濃度的H2O2才能激活Hog1。

圖1H2O2促進白念珠菌Gpx3 / Ybp1介導(dǎo)的氧化反應(yīng)，激活Cap1轉(zhuǎn)錄因子(Cap1RED→Cap1ox)。Cap1ox不再與核輸出因子Crm1相互作用，導(dǎo)致Cap1在核內(nèi)積聚，激活 Cap1依賴的抗氧化應(yīng)激的基因，保證細胞的存活。經(jīng)過細胞自身調(diào)整，Cap1ox又可以在Trx1的調(diào)控下轉(zhuǎn)化為失活狀態(tài)(Cap1RED)。圖2H2O2激活Hog-MAPK通路。上游信號(Sln1等)促使磷酸基團由MAPKKK向MAPK逐步傳遞，Hog通路被激活，最后磷酸化的Hog1發(fā)生核轉(zhuǎn)位進入細胞核內(nèi)，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，使細胞可以耐受氧化應(yīng)激壓力。

Fig.1H2O2promoted Gpx3/Ybp1-mediated oxidation ofCandidaalbicansand activated the transcription factor Cap1REDto Cap1ox. Cap1oxcould no longer interact with the nuclear export factor Crm1, which caused the accululation of Cap1 within the nucleus. Then the expression of Cap1-dependent anti-oxidative stress genes were up-regulated, ensuring the survival of the organism. As a strategy for homeostasis, Cap1oxcould be transformed into inactive state (Cap1RED) in the existence of Trx1.Fig.2H2O2activated the Hog-MAPK pathway. The upstream signals such as Sln1 promoted the transferance of phosphate group from MAPKKK to MAPK, then the Hog pathway was activated. Finally, the phosphorylated Hog1 was transferred into the nucleus and regulated the expression of related genes, which allowing theCandidaalbicansto withstand oxidative stress.

Hog-MAPK通路對毒力的影響 在ROS、滲透壓和抗菌肽的作用下，白念珠菌的Hog1磷酸化，并且在核內(nèi)大量積聚[26]。在小鼠感染或其他共生模型中[26-28]，缺乏Hog1的白念珠菌，其毒力受到明顯抑制，更容易被巨噬細胞或中性粒細胞殺死[29]。因為Hog1調(diào)控不同的應(yīng)激反應(yīng)，因此很難判斷是Hog1通過氧化應(yīng)激的作用間接影響了毒力，還是Hog-MAPK通路直接參與了毒力的形成。

3.3 Rad53(DNA損傷檢驗點)通路

暴露于H2O2后，白念珠菌形成超極化芽(hyperpolarized buds)[20]從而逃避吞噬作用，它在形態(tài)上不同于菌絲和假菌絲。H2O2誘導(dǎo)的超極化芽的出現(xiàn)，不依賴于菌絲形成的調(diào)節(jié)因子Efg1和Cph1，而是通過Rad53激活的[30]。遺傳毒性壓力如紫外線，甲基磺酸甲酯(MMS)和羥基脲，可以激活白念珠菌的Rad53激酶[30]，ROS可以造成DNA損傷[31]，并觸發(fā)Rad53 DNA檢查點通路的激活[32]，引起Rad53磷酸化，形成超極化芽[20]。Rad53缺失或Rad53上游調(diào)控子缺失后，則不能生成超極化芽[30]。

3.4 氧化應(yīng)激相關(guān)的其他信號途徑

cAMP/PKA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對白念珠菌氧化應(yīng)激有負向調(diào)節(jié)作用。該通路通過滅活磷酸二酯酶Pde2，降解cAMP，從而導(dǎo)致白念珠菌對H2O2的敏感性增加[33]。法尼醇通過抑制cAMP/PKA信號通路，導(dǎo)致白念珠菌對H2O2的耐受性增強，這一過程可能涉及一系列抗氧化基因表達水平的變化[34]。

4 小 結(jié)

白念珠菌氧化應(yīng)激機制是一個重要的研究領(lǐng)域，對于病原真菌來說，耐受氧化應(yīng)激是一種重要的毒力，對氧化應(yīng)激不耐受的白念珠菌，對抵御吞噬細胞的殺傷能力下降。氧化應(yīng)激可以對白念珠菌產(chǎn)生損傷，但相反白念珠菌也通過各種機制來應(yīng)對氧化損傷。目前關(guān)于白念珠菌的氧化應(yīng)激及毒力還有很多問題亟待解決，這對于我們理解疾病發(fā)展過程中白念珠菌與宿主之間的相互作用至關(guān)重要，同樣氧化應(yīng)激也可能成為新型抗真菌藥物的作用靶點。