董 輝，李軒豪，常靜林，賀 欣，侯沁蓮，龍 偉

中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 放射醫(yī)學研究所天津市放射醫(yī)學與分子核醫(yī)學重點實驗室，天津 300192

高效聚γ谷氨酸(poly-γ-glutamate，γ-PGA)是一種陰離子、可生物降解的水溶性生物聚合物，可以食用且對人體和環(huán)境無害[1]。這種生物聚合物具有多種功能，已廣泛應用于食品、化妝品、藥品和水處理等工業(yè)領域。因此，從工業(yè)觀點來看，其潛在的應用已被研究[2- 3]。由于D-和/或L-構型的谷氨酸鹽通過γ-酰胺鍵聚合，在每一個谷氨酸單元(γ-L-PGA和γ-D-PGA)中存在手性中心旋光性聚合物，不同的聚合物有不同的用途。那么，為了讓這個有前途的生物聚合物用于實際的工業(yè)生產中，兩個主要問題仍有待解決：如何以更適中的價格大量生產，以及如何控制其結構的多樣性[2]。

γ-PGA首先在20世紀初被描述于炭疽菌群(Bacillusanthracis)，這種菌株也生產γ-D-PGA。然而，由于其生物毒性，不能直接使用這種微生物。有研究證明，一些細菌(大部分來自芽孢桿菌屬)可分泌γ-PGA作為發(fā)酵的產物到培養(yǎng)基中[4]。這些細菌中，研究最深入的是枯草芽孢桿菌(B.subtilis)與地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)[5- 6]。與地衣芽孢桿菌相比，枯草芽孢桿菌則顯示出更高的生產力，因此這種菌株的應用越來越受到人們的重視[7]。枯草芽孢桿菌是一種能夠產生內生孢子、需氧的革蘭氏陽性菌。γ-PGA由枯草芽孢桿菌(納豆)所產生，在日本被用作發(fā)酵大豆食品納豆的起動器，具有悠久的歷史[8]。最近，從土壤中分離出的枯草芽孢桿菌菌株被命名為枯草芽孢桿菌KH2，已保藏于中國普通微生物培養(yǎng)收集中心(CGMCC № 12426)。研究顯示，在含有4%L-谷氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該菌株48 h后，γ-PGA產率達到最大41 g/L。在所用條件下，γ-谷氨酸含量維持在84%～86%，避免了不規(guī)則的立體化學問題[2]。本研究描述了枯草芽孢桿菌CGMCC 12426的微生物特征，對其進行了全基因組測序和注釋，以期為將來該菌株的代謝和調控機制的深入研究提供實驗基礎。

材料和方法

分類和特點枯草芽孢桿菌菌株KH2(CGMCC 12426)是革蘭氏陽性需氧菌，能夠產生內生孢子，為桿狀芽孢桿菌，最適生長條件為pH為7.0、30℃(表1、圖1)。在LB瓊脂培養(yǎng)基上生長時，菌落呈乳白色，表面光滑。能產生過氧化氫酶。菌株KH2能夠利用D-葡萄糖、麥芽糖、乳糖和蔗糖作為唯一碳源?；?6S rRNA基因的BLAST結果，菌株KH2與枯草芽孢桿菌物種的相似度最高[9]。菌株KH2和枯草芽孢桿菌DSM 10T之間的16S rRNA基因序列的相似性為100%。在默認設置下，從菌株KH2的基因組序列中得到16S rRNA基因的完整序列，從NCBI數(shù)據(jù)庫中調取芽孢桿菌屬的代表性成員序列[10- 15]，使用鄰接連接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析菌株KH2和芽孢桿菌屬其他成員之間的系統(tǒng)進化關系(圖2)。

基因組測序選擇枯草芽孢桿菌CGMCC 12426用于測序，因為它能生產具有規(guī)則立體化學的γ-PGA?；蚪M序列提交至Genbank公用數(shù)據(jù)庫，存儲號為CP018184-CP018185，基因組信息存放在Gp0203613的Genomes on Line Database中[18]?；蚪M測序和注釋由上海中國人類基因組中心進行。該項目的總結如表2所示。

菌株生長條件和基因組DNA制備：將枯草芽孢桿菌CGMCC 12426接種在50 ml LB培養(yǎng)基中，并在轉度為200 r/min的搖床中30℃培養(yǎng)12 h。使用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen，CA)提取枯草芽孢桿菌CGMCC 12426的基因組DNA。在Agilent 2100生物分析儀(Agilent，美國)上評估基因組DNA的數(shù)量和質量。將基因組DNA儲存在-20℃冷凍器中。

基因組測序和組裝：使用基因組DNA構建10 kb插入片段SMRT-bell文庫，然后在Pacific Biosciences(PacBio)RS Ⅱ測序儀(Pacific Biosciences，CA)的單分子實時(SMRT)DNA測序平臺上測序[19]。在1個3 h電影次數(shù)的SMRT細胞上共計150 292次聚合酶讀數(shù)，最終獲得總共1 386 478 854個核苷酸堿基。經過濾除去低精度值小于0.8的讀數(shù)后，以0.866讀數(shù)質量獲得1 256 996 185讀數(shù)堿基。所有過濾的序列在SMRT分析軟件2.3.0版(Pacific Biosciences)中使用RS等級基因組裝配過程(HGAP)裝配協(xié)議2.0進行重新組裝[20]。

基因組注釋：使用NCBI原核基因組注釋管道(prokaryotic genome annotation pipeline，PGAP)進行注釋。用KEGG數(shù)據(jù)庫于重建代謝途徑[21]。通過RNAmmer和tRNAscan-SE程序預測核糖體RNA和轉移RNA[22- 23]。

結 果

菌株CGMCC 12426完整基因組序列由長度為74 165 bp的質粒和長度為4 138 265 bp的環(huán)狀染色體組成?；蚪MG + C含量為43.4 mol%。在CGMCC 12426基因組中預測了4581個ORF，30組rRNA(5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA)操縱子和87個tRNA(表3)。在總共4581個預測ORFs中，3288個是功能單位，其中1173個被注釋為假設蛋白質。當根據(jù)COG類別分析生物學作用時，氨基酸轉運和代謝蛋白占所有功能分配蛋白質的最大數(shù)量(307)，其次是轉錄蛋白(304)和碳水化合物轉運和代謝蛋白質(286)?；蛟贑OGs功能分類中的分布見表4。該菌株包含1個質粒，該質粒的重要基因及其功能注解見表5。

表1 根據(jù)MIGS建議的枯草芽孢桿菌CGMCC 12426的分類和一般特征[16]Table 1 Classification and general characteristics of Bacillus subtilis CGMCC 12426 suggested by MIGS

證據(jù)代碼-從直接分析中推斷出IDA，TAS可追溯作者陳述(即文獻中存在直接報告)，NAS不可追溯作者陳述(即，不直接觀察活的、孤立的樣本，但基于該物種的普遍特性，或軼事證據(jù))，這些證據(jù)代碼來自基因本體項目

Evidence codes-IDA inferred from direct assay；TAS，traceable author statement(i.e.，a direct report exists in the literature)；NAS，non-traceable author statement(i.e.，not directly observed for the living，isolated sample but based on a generally accepted property for the species or anecdotal evidence),these evidence codes come from the Gene Ontology project[17]

圖1菌株KH2的透射電子顯微鏡

Fig1Transmission electron microscopy of strain KH2

這些菌株及其16S rDNA序列的GenBank登錄號分別為：枯草芽孢桿菌KH2(CP018184)、枯草芽孢桿菌PPL-SC9(KM226924)、淀粉樣芽孢桿菌BCRC 11601(NR_116022)、秈型芽孢桿菌SD/3(AJ583158)、偶氮共振菌NBRC 15712(AB363732)、甲烷芽孢桿菌NCIMB 13113(AB112727)、硫雜環(huán)桿菌BMP- 1(DQ371431)、硒砷芽孢桿菌SF- 1(AB262082)、柯氏芽孢桿菌DSM 6307(X76437)、蠟樣芽孢桿菌ATCC 14579(NR_074540)、砷桿菌cona/3(AJ606700)、結核分枝桿菌MLTeJB(FJ825145)、砷黃桿菌E1H(AF064705)和麻黃芽孢桿菌JMM- 4(AY32601)

The strains and their corresponding GenBank accession numbers for 16S rDNA sequences areBacillussubtilisstrain KH2(CP018184)，BacillussubtilisPPL-SC9(KM226924)，BacillusamyloliquefaciensBCRC 11601(NR_116022)，BacillusindicusSd/3(AJ583158)，BacillusazotoformansNBRC 15712(AB363732)，BacillusmethanolicusNCIMB 13113(AB112727)，BacillusthioparansBMP- 1(DQ371431)，BacillusselenatarsenatisSF- 1(AB262082)，BacilluscohniiDSM 6307(X76437)，BacilluscereusATCC 14579(NR_074540)，Bacillusarsenicuscon a/3(AJ606700)，BacillusbeveridgeiMLTeJB(FJ825145)，BacillusarseniciselenatisE1H(AF064705)，andBacillusmacyaeJMM- 4(AY032601)

圖2基于16S rRNA基因序列的MEGA 5構建的鄰接系統(tǒng)發(fā)生樹

Fig2Adjacent phylogenetic trees constructed based on the 16S rRNA gene sequence(by MEGA 5 phylogeny software)

表2 基因組測序項目信息Table 2 Genome sequencing project information

表3 枯草芽孢桿菌菌株CGMCC 12426的基因組統(tǒng)計Table 3 Genome statistics of Bacillus subtilis strain CGMCC 12426

NA：無法使用

NA：not available

表4 與一般COG功能類別相關的基因數(shù)量Table 4 The number of genes associated with general COG function categories

總數(shù)是根據(jù)注釋基因組中蛋白質編碼基因的總數(shù)計算

The total is based on the total number of protein coding genes in the annotated genome

表5 枯草芽孢桿菌菌株CGMCC 12426質粒的重要相關基因及其功能Table 5 Important genes and functions of Bacillus subtilis strain CGMCC 12426

討 論

枯草芽孢桿菌CGMCC 12426的基因組測序進一步闡明了該菌株的遺傳背景和基礎，為研究乙醇、有機酸、氨基酸等形成的代謝和調控機制提供了重要理論依據(jù)。與枯草芽孢桿菌亞種枯草芽孢桿菌菌株168的擴展研究模型菌株相比，枯草芽孢桿菌菌株KH2的遺傳操作效率低得多。基因比對分析發(fā)現(xiàn)，KH2中存在1個限制性內切酶，WP_014480489.1 type I restriction-modification system deoxyribonuclease，該酶的存在很可能是KH2這個菌株遺傳操作效率比枯草芽孢桿菌菌株168低很多的原因所在。對這兩種菌株的基因組特征的比較分析結果發(fā)現(xiàn)，兩種菌株間只有較小的差異，相似度較高(表6)。該結果有助于鑒定合適的靶基因，可通過系統(tǒng)代謝工程幫助開發(fā)具有更高濃度、產量且生產率優(yōu)良的微生物細胞工廠。

總之，枯草芽孢桿菌CGMCC 12426基因組測序的完成，為其菌株代謝工程改造及調控機制研究提供了大量的生物學信息。該基因組測序為進一步闡明該菌株的遺傳背景提供了基礎，也為研究代謝和調控機制提供了重要理論依據(jù)。使得以適中的價格大量生產γ-PGA，以及控制其結構的多樣性成為了可能，隨著枯草芽孢桿菌功能基因組學研究的不斷深入，將會獲得更多優(yōu)良性狀的基因工程菌株，推進生產γ-PGA的產業(yè)化進程。

表6 菌株KH2和菌株168之間的基因組特征的比較Table 6 Comparison of genomic features between Strain KH2 and Strain 168