朱秀靈 戴清源 王 楓 陶仁友 曹昕昕 許祚文 張志祥

(1. 安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000；2. 蕪湖益然香木榨食用油有限公司，安徽 蕪湖 241100)

芝麻素酚三糖苷是由三分子葡萄糖與一分子芝麻素酚以糖苷鍵連接而成，是芝麻餅粕中含量最高的一種水溶性木酚素[1-2]。與脂溶性木酚素如芝麻素、芝麻林素和芝麻素酚等相比，芝麻素酚三糖苷水溶性較好，體外抗氧化活性較弱[3-4]，但在體內(nèi)腸道菌群及β-葡萄糖苷酶作用下可以轉(zhuǎn)化為具有較強(qiáng)抗氧化活性的芝麻素酚及其他酚類化合物，能夠降低機(jī)體氧化應(yīng)激水平[2,5-6]，對(duì)機(jī)體健康發(fā)揮有益作用。

作為膳食成分，芝麻素酚三糖苷通常以脫皮或未脫皮芝麻籽、芝麻醬、芝麻芽菜等食物形式被人體攝入，在這些食物加工過程中，芝麻籽可能經(jīng)過酸堿脫皮、高溫焙炒、高壓蒸煮、高溫油炸、溫控發(fā)芽等一種或多種處理，致使芝麻素酚三糖苷分子也不同程度地受到光、熱、氧(空氣)、酸、堿、酶及高壓蒸汽的影響。目前已有研究[7]27-37[8]報(bào)道芝麻素酚三糖苷能被β-葡萄糖苷酶水解生成芝麻素酚，而對(duì)其他因素如光、熱、氧、酸堿及高壓蒸汽是否穩(wěn)定，尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究以實(shí)驗(yàn)室自制芝麻素酚三糖苷提取物為研究對(duì)象，探討光、熱、氧、酸、堿、酶及高壓蒸汽處理對(duì)芝麻餅粕提取物中芝麻素酚三糖苷穩(wěn)定性的影響，以期為進(jìn)一步探討芝麻素酚三糖苷在多因素作用下的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)化規(guī)律提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

芝麻餅粕：蕪湖益然香木榨食用油有限公司；

α-葡萄糖苷酶(來源于黑曲霉，71 U/mg)、α-半乳糖苷酶(≥9 U/mg)、β-半乳糖苷酶(300 U/mg)：中國(guó)Sigma-Aldrich公司；

β-葡萄糖苷酶(來源于黑曲霉)：110 U/g，上海麥克林生化科技有限公司；

正己烷、無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

芝麻素酚三糖苷標(biāo)準(zhǔn)品：HPLC純度98%以上，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.2 儀器與設(shè)備

鼓風(fēng)干燥箱：ZFD-A5140型，上海智城分析儀器制造有限公司；

萬能粉碎機(jī)：FW-100型，金壇市杰瑞爾電器有限公司；

往返式氣浴恒溫振蕩器：SHA-S型，金壇市杰瑞爾電器有限公司；

臺(tái)式低速大容量離心機(jī)：L-550型，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；

多功能循環(huán)水真空泵：SHZ-Ⅲ型，鄭州上街華科儀器廠；

液相色譜儀：LC-2010型，日本島津公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 芝麻素酚三糖苷提取物的制備 參照Z(yǔ)hu等[9]方法制備芝麻餅粕提取物，具體如下：將芝麻餅粕于50 ℃鼓風(fēng)干燥6 h，萬能粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，按料液比1∶10(g/mL)加入正己烷，于氣浴振蕩器(120 r/min)中室溫脫脂8 h，離心(4 500 r/min，10 min)，收集上清液，殘?jiān)韵嗤绞矫撝?次，上清液合并、減壓蒸發(fā)，回收正己烷并得到芝麻油，殘?jiān)匀伙L(fēng)干即為脫脂芝麻粕。稱取一定質(zhì)量的脫脂芝麻粕按料液比1∶10(g/mL)加入80%乙醇，于氣浴振蕩器(120 r/min)中室溫浸提8 h，離心(4 500 r/m，10 min)，收集上清液，沉淀以相同方式浸提2次，將上清液合并、減壓濃縮、真空干燥，即得到芝麻餅粕提取物。將芝麻餅粕提取物用蒸餾水溶解并配成濃度為10 mg/mL溶液，0.45 μm濾膜過濾，進(jìn)行聚酰胺柱層析(3.0 cm×60 cm)，每次上樣10 mL，蒸餾水洗脫，洗脫流速1.0 mL/min，洗脫液用自動(dòng)部分收集器收集(10 mL/管)，高效液相色譜法檢測(cè)洗脫液中芝麻素酚三葡萄糖苷，將含有芝麻素酚三糖苷組分的洗脫液合并，減壓濃縮，真空干燥即得到芝麻素酚三糖苷提取物。

1.2.2 芝麻素酚三糖苷含量的測(cè)定 將芝麻素酚三糖苷提取物用80%乙醇溶解并定容至10 mL，0.45 μm濾膜過濾，采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定溶液中芝麻素酚三糖苷的含量[9]，色譜條件：色譜柱TSKgel ODS-80T(s) (4.6 mm×250 mm)，紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)290 nm，流速0.6 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量20 μL，每個(gè)樣品檢測(cè)時(shí)間30 min，流動(dòng)相：A相為甲醇，B相為水，A相與B相體積比6∶4。

精確稱取10 mg芝麻素酚三糖苷標(biāo)準(zhǔn)品，用80%乙醇溶解并定容至25 mL得到400 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品母液，用80%乙醇稀釋分別得到濃度為5，20，40，80，100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，高效液相色譜檢測(cè)，以峰面積為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照保留時(shí)間是否與標(biāo)準(zhǔn)品一致對(duì)待測(cè)液中芝麻素酚三葡萄糖苷進(jìn)行定性分析，根據(jù)峰面積，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)液中芝麻素酚三糖苷的含量。芝麻素酚三糖苷提取物中芝麻素酚三糖苷的含量按式(1)計(jì)算。

(1)

式中：

ω——芝麻素酚三糖苷提取物中芝麻素酚三糖苷的含量，mg/g；

C——待測(cè)液中芝麻素酚三糖苷濃度，μg/mL；

V——待測(cè)液的體積，mL；

m——芝麻素酚三糖苷提取物的質(zhì)量，mg。

1.2.3 光、熱、氧(空氣)對(duì)芝麻素酚三糖苷穩(wěn)定性的影響

參照文獻(xiàn)[10—11]報(bào)道的方法并加以修改，具體描述如下：準(zhǔn)確稱取30 mg芝麻素酚三糖苷提取物，用蒸餾水溶解并配成濃度為200 μg/mL溶液。等量量取該溶液各10 mL分別放入10個(gè)25 mL的帶塞玻璃試管中，將其中8只試管用保鮮膜封口，分別放在試驗(yàn)臺(tái)上、避光處、光照箱、水浴鍋(設(shè)定溫度100 ℃)中各2管，再將剩余的2管置于氣浴振蕩器中以200 r/min往復(fù)震蕩，有利于樣品與空氣中的氧充分接觸。其中，試驗(yàn)臺(tái)、避光、光照箱及水浴試驗(yàn)，分別考察常規(guī)操作、暗光、光照操作及熱處理對(duì)芝麻素酚三糖苷穩(wěn)定性的影響。將不同處理?xiàng)l件下的樣品分別于8 h及24 h各取出1管，用高效液相色譜檢測(cè)芝麻素酚三糖苷的含量，檢測(cè)結(jié)果與0 h時(shí)芝麻素酚三糖苷含量進(jìn)行比較，結(jié)果以芝麻素酚三糖苷的保存率表示。

1.2.4 鹽酸對(duì)芝麻素酚三糖苷穩(wěn)定性的影響 參照文獻(xiàn)[12]采用高濃度鹽酸水解的方法，并加以修改，具體描述如下：準(zhǔn)確稱取10 mg芝麻素酚三糖苷提取物，按料液比1∶5(mg/mL)加入4.5 mol/L鹽酸溶液，充分震蕩。等量量取該溶液10 mL分別放到2個(gè)25 mL的帶塞玻璃試管中并于37 ℃恒溫水浴中分別酸解8 h和24 h，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)各樣品pH至7.0(調(diào)節(jié)pH至中性，便于高效液相色譜檢測(cè))，記錄溶液體積，用0.45 μm 濾膜分別過濾，進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與0 h時(shí)芝麻素酚三糖苷含量進(jìn)行比較，結(jié)果以芝麻素酚三糖苷的保存率表示。

1.2.5 堿液(氫氧化鈉)對(duì)芝麻素酚三糖苷穩(wěn)定性的影響

參照文獻(xiàn)[13]采用4.5 mol/L NaOH溶液處理芝麻素酚三糖苷溶液，具體方法描述如下：將10 mg芝麻素酚三糖苷提取物，按料液比1∶5(mg/mL)加入4.5 mol/L NaOH溶液，充分震蕩。然后采用與鹽酸處理相同的方法進(jìn)行堿液處理。各樣品經(jīng)堿液處理后，用2 mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.0，再用0.45 μm濾膜過濾，進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，計(jì)算芝麻素酚三糖苷的保存率。

1.2.6 酶液處理對(duì)芝麻素酚三糖苷穩(wěn)定性的影響 采用pH 5.0醋酸緩沖溶液分別配制α-半乳糖苷酶[14]、β-半乳糖苷酶[15]、α-葡萄糖苷酶[16]和β-葡萄糖苷酶溶液[2]，各種酶液的終濃度均為2.0 mg/mL。將10 mg等量份的芝麻素酚三糖苷提取物分別加入到上述酶液(各50 mL)中，充分震蕩使其溶解，等量量取各溶液10 mL 2份，分別放到2個(gè)25 mL的帶塞玻璃試管中，于37 ℃恒溫震蕩酶解，各酶酶解時(shí)間分別為8，24 h，酶解結(jié)束將樣品煮沸5 min鈍化酶，冷卻至室溫，0.45 μm濾膜過濾，進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，以各酶作用時(shí)間為0 h時(shí)的溶液作為對(duì)照，計(jì)算芝麻素酚三糖苷的保存率。

1.2.7 高壓蒸汽處理對(duì)芝麻素酚三糖苷穩(wěn)定性的影響

參照Xu等[17]報(bào)道的方法，并加以修改，具體如下：將10 mg 芝麻素酚三糖苷提取物按料液比1∶5 (mg/mL)加入蒸餾水溶解，其濃度為200 μg/mL溶液，等量量取10 mL 各3份置于25 mL 試管中，分別放入高壓蒸汽滅菌鍋中于1.01×105Pa、121 ℃處理30 min。將處理后的溶液用0.45 μm濾膜過濾，進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，以未高壓蒸汽處理的溶液作為對(duì)照，計(jì)算芝麻素酚三糖苷的保存率。

1.2.8 芝麻素酚三糖苷的穩(wěn)定性評(píng)價(jià) 不同處理?xiàng)l件下芝麻素酚三糖苷的穩(wěn)定性，可以根據(jù)高效液相色譜特征峰面積變化以及是否出現(xiàn)新的特征峰進(jìn)行判斷，在量變上表現(xiàn)為不同方法處理前后芝麻素酚三糖苷含量的變化即保存率不同。本研究以芝麻素酚三糖苷的保存率表示其穩(wěn)定性，計(jì)算公式：

(2)

式中：

d——芝麻素酚三糖苷的保存率，%；

C0——不同方法處理前芝麻素酚三糖苷的含量，μg/mL；

C1——不同方法處理后芝麻素酚三糖苷的含量，μg/mL；

V0——不同方法處理前溶液的體積，mL；

V1——不同方法處理后溶液的體積，mL。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)表示。采用SPSS V22.0(IBM-SPSS, USA)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 芝麻素酚三糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及含量測(cè)定

芝麻素酚三糖苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，線性方程為Y=32.811 6X-7.613 5(R2=0.998 2)，線性范圍5～100 μg/mL。

圖1 芝麻素酚三糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)線性方程計(jì)算得出脫脂芝麻餅粕中芝麻素酚三糖苷含量為(1.08±0.05) mg/g，80%乙醇提取物即芝麻餅粕提取物中芝麻素酚三糖苷含量為(3.16±0.11) mg/g，經(jīng)聚酰胺柱層析初步純化得到芝麻素酚三糖苷提取物，該提取物中芝麻素酚三糖苷含量為(476.11±7.52) mg/g。

2.2 光、熱、氧(空氣)對(duì)芝麻素酚三糖苷穩(wěn)定性的影響

已有研究[18-19]報(bào)道，在芝麻籽加熱焙炒、芝麻油精制操作如酸性粘土脫色或者酸性離子交換樹脂催化作用下，芝麻林素可以轉(zhuǎn)換為芝麻素酚，而芝麻素酚三糖苷在熱處理?xiàng)l件下的穩(wěn)定性未見報(bào)道。本研究中光、熱、氧對(duì)芝麻素酚三糖苷穩(wěn)定性的影響，如圖2所示。室溫、避光、光照及水浴處理后，芝麻素酚三糖苷的保存率均在99.94%以上，處理方式及處理時(shí)間對(duì)芝麻素酚三糖苷保存率的影響不顯著(P>0.05)，說明在本試驗(yàn)條件下，芝麻素酚三糖苷對(duì)光、熱、氧(空氣)非常穩(wěn)定。

A、B、C、D分別表示室溫、避光、光照及水浴處理

2.3 鹽酸處理對(duì)芝麻素酚三糖苷穩(wěn)定性的影響

如圖3所示，鹽酸處理時(shí)間由0 h增大至24 h，芝麻素酚三糖苷特征峰越來越小，當(dāng)鹽酸處理24 h時(shí)，芝麻素酚三糖苷特征峰最小，并且出現(xiàn)了化合物2和化合物3的特征峰。根據(jù)高效液相色譜圖中芝麻素酚三糖苷對(duì)應(yīng)的峰面積，以鹽酸處理0 h時(shí)芝麻素酚三糖苷含量為對(duì)照，由式(1)、(2)分別計(jì)算得出鹽酸處理8，24 h芝麻素酚三糖苷的保存率分別為23.85%和4.27%(見圖9)，結(jié)果表明，高濃度鹽酸處理導(dǎo)致芝麻素酚三糖苷結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，使其結(jié)構(gòu)降解或轉(zhuǎn)化為其他化合物，與文獻(xiàn)[7]7報(bào)道不一致。文獻(xiàn)[7]7報(bào)道，在酸性條件(pH 0.8～1.5，HCl)下芝麻素酚三糖苷無水解現(xiàn)象，而且除了3個(gè)新的色譜峰，并未檢測(cè)到相應(yīng)的芝麻素酚或者其他芝麻素酚糖苷化合物，據(jù)猜測(cè)，3個(gè)新的色譜峰可能是芝麻素酚的同分異構(gòu)體。本研究中，芝麻素酚三糖苷經(jīng)高濃度鹽酸處理后產(chǎn)生2個(gè)新的特征峰，分別對(duì)應(yīng)化合物2和化合物3，有待于進(jìn)一步鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。

a、b、c分別為處理0，8，24 h時(shí)溶液的高效液相色譜圖；峰1為芝麻素酚三糖苷；峰2和3分別為新化合物

圖3 鹽酸處理芝麻素酚三糖苷提取物的高效液相色譜圖

Figure 3 HPLC chromatograms of sesaminol triglucoside extract with hydrochloric acid treatment

2.4 堿液(氫氧化鈉)處理對(duì)芝麻素酚三糖苷穩(wěn)定性的影響

由圖4可以看出，芝麻素酚三糖苷經(jīng)高濃度堿液處理未出現(xiàn)新的特征峰，隨著堿液處理時(shí)間的延長(zhǎng)芝麻素酚三糖苷特征峰面積隨之增大，說明堿液處理對(duì)芝麻素酚三糖苷無破壞作用。根據(jù)峰面積大小，以堿液處理0 h時(shí)芝麻素酚三糖苷含量為對(duì)照，由式(1)、(2)分別計(jì)算得出堿液處理8，24 h時(shí)芝麻素酚三糖苷的保存率分別為118.31%和146.84%(見圖9)。峰面積隨著堿液處理時(shí)間延長(zhǎng)不僅未減少反而增加，其原因可能是芝麻素酚三糖苷不純，其提取物中非芝麻素酚三糖苷成分在高濃度堿液作用下發(fā)生轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與芝麻素酚三糖苷有著相近的保留時(shí)間，峰面積增大可能是保留時(shí)間相近的多個(gè)組分疊加的結(jié)果。

2.5 酶處理對(duì)芝麻素酚三糖苷穩(wěn)定性的影響

α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶及β-半乳糖苷酶對(duì)芝麻素酚三糖苷穩(wěn)定性的影響，如圖5～9所示。

a、b、c分別為處理0，8，24 h時(shí)溶液的高效液相色譜圖；峰1為芝麻素酚三糖苷

圖4 堿液處理芝麻素酚三糖苷提取物的高效液相色譜圖

Figure 4 HPLC chromatograms of sesaminol triglucoside extract with alkali treatment

a、b、c分別為處理0，8，24 h時(shí)溶液的高效液相色譜圖；峰1為芝麻素酚三糖苷

圖5α-葡萄糖苷酶處理芝麻素酚三糖苷提取物的高效液相色譜圖

Figure 5 HPLC chromatograms of sesaminol triglucoside extract withα-glucosidase treatment

由圖5、9可以看出，α-葡萄糖苷酶處理前后，芝麻素酚三糖苷的特征峰相似，其含量無顯著性變化(P>0.05)，保存率在8 h或24 h時(shí)均為99.92%以上，說明α-葡萄糖苷酶處理對(duì)芝麻素酚三糖苷的穩(wěn)定性無顯著性影響。由圖6看出，β-葡萄糖苷酶作用于芝麻素酚三糖苷分子(化合物1)，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，芝麻素酚三糖苷特征峰越來越小，而化合物2特征峰卻隨之增大，在24 h時(shí)，芝麻素酚三糖苷的保存率不足3.0%(見圖9)，說明芝麻素酚三糖苷對(duì)β-葡萄糖苷酶不穩(wěn)定。已有研究[2][7]32-33報(bào)道，芝麻素酚三糖苷可被β-葡萄糖苷酶水解轉(zhuǎn)化為芝麻素酚，如果同時(shí)添加纖維素酶和β-葡萄糖苷酶，芝麻木酚素糖苷類化合物水解得到的芝麻素酚更多。本研究中，β-葡萄糖苷酶對(duì)芝麻素酚三糖苷穩(wěn)定性的影響與現(xiàn)有報(bào)道一致。由圖7～9可以看出，用α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶分別處理芝麻素酚三糖苷提取物，均能導(dǎo)致芝麻素酚三糖苷分子降解。當(dāng)酶作用時(shí)間為8 h時(shí)，α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶處理溶液中芝麻素酚三糖苷特征峰變小，并且兩種處理溶液均出現(xiàn)2個(gè)新的特征峰；延長(zhǎng)酶作用時(shí)間至24 h，芝麻素酚三糖苷特征峰幾乎消失，兩種酶液處理后芝麻素酚三糖苷的保存率均小于5%，可能與α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶的酶解作用導(dǎo)致芝麻素酚三糖苷分子降解或者轉(zhuǎn)換為其他化合物有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究。

a、b、c分別為處理0，8，24 h時(shí)溶液的高效液相色譜圖；峰1為芝麻素酚三糖苷；峰2為新化合物

圖6β-葡萄糖苷酶處理芝麻素酚三糖苷提取物的高效液相色譜圖

Figure 6 HPLC chromatograms of sesaminol triglucoside extract withβ-glucosidase treatment

a、b、c分別為處理0，8，24 h時(shí)溶液的高效液相色譜圖；峰1為芝麻素酚三糖苷；峰2和3分別為新化合物

圖7α-半乳糖苷酶處理芝麻素酚三糖苷提取物的高效液相色譜圖

Figure 7 HPLC chromatograms of sesaminol triglucoside extract withα-galactosidase treatment

a、b、c分別為處理0，8，24 h時(shí)溶液的高效液相色譜圖；峰1為芝麻素酚三糖苷；峰2、3和4分別為新化合物

圖8β-半乳糖苷酶處理芝麻素酚三糖苷提取物的高效液相色譜圖

Figure 8 HPLC chromatograms of sesaminol triglucoside extract withβ-galactosidase treatment

A、B、C、D、E、F分別表示鹽酸、堿液、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶及β-半乳糖苷酶處理

圖9 不同處理?xiàng)l件對(duì)芝麻素酚三糖苷穩(wěn)定性的影響

Figure 9 Effect of different treatment on the stability of sesaminol triglucoside

2.6 高壓蒸汽處理對(duì)芝麻素酚三糖苷穩(wěn)定性的影響

將芝麻素酚三糖苷水溶液置于高壓蒸汽滅菌鍋中，在121 ℃、1.01×105Pa下作用30 min，芝麻素酚三糖苷的高效液相色譜特征峰及峰面積大小無明顯變化，其保存率約99.96%，說明芝麻素酚三糖苷在高壓蒸汽作用下穩(wěn)定性好。

3 結(jié)論

本研究主要探討光、熱、氧(空氣)、酸、堿、酶及高溫高壓處理對(duì)芝麻素酚三糖苷穩(wěn)定性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，光、熱、氧(空氣)、堿液(氫氧化鈉)、高溫高壓及α-葡萄糖苷酶處理對(duì)芝麻素酚三糖苷穩(wěn)定性無顯著性影響；鹽酸、β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶及β-半乳糖苷酶處理均可導(dǎo)致芝麻素酚三糖苷分子降解或轉(zhuǎn)化為其他化合物，其穩(wěn)定性隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)顯著性降低。

在食品加工過程中，芝麻素酚三糖苷結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性會(huì)受到多種因素的影響，本研究雖探討了單因素作用下芝麻素酚三糖苷的穩(wěn)定性，但未對(duì)于不同因素不同水平及多因素作用下的穩(wěn)定性及其降解和轉(zhuǎn)化規(guī)律進(jìn)行探討，這些將在后期研究中深入探討。