姚樂輝

(許昌學(xué)院體育學(xué)院，河南 許昌 461000)

腸道對人們的健康非常關(guān)鍵。隨著分子生物技術(shù)的逐漸發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了越來越多無法培養(yǎng)的微生物，腸道微生物的構(gòu)成與功能一般會隨宿主的基因、飲食以及環(huán)境等的改變而改變[1-2]?，F(xiàn)階段認(rèn)為影響人體腸道微生物變化的原因有很多方面，盡管遺傳因素能夠決定個體腸道微生物的定殖，然而環(huán)境與生活方式，特別是膳食結(jié)構(gòu)的變化成為影響人體腸道微生態(tài)的主要因素[3-4]。人體腸道微生物利用形成的酶消化營養(yǎng)物質(zhì)，以及形成的代謝產(chǎn)物影響著人們的身體健康，而身體提供的營養(yǎng)物質(zhì)、類型以及數(shù)量也會對腸道微生物代謝產(chǎn)生很大的影響[5-6]。

近年來由于中國人群膳食結(jié)構(gòu)的變化出現(xiàn)部分慢性非傳染性疾病[7]。盡管膳食僅為生活方式中的一種因素，但對人們的身體健康起到非常關(guān)鍵的作用。相關(guān)研究學(xué)者對不同膳食結(jié)構(gòu)對腸道微生物代謝影響進(jìn)行了研究，謝佳琦等[8]對膳食脂肪對腸道微生物的影響進(jìn)行研究，分析了膳食中脂肪對微生物代謝的影響，但是未對人體血糖變化及具體微生物變化情況進(jìn)行具體研究，研究的全面性不足。張烽等[9]對膳食營養(yǎng)與人體腸道微生物組之間關(guān)系進(jìn)行研究，只考慮了營養(yǎng)成分對人體腸道微生物的數(shù)量的變化，但未對微生物代謝狀況進(jìn)行研究。本試驗擬研究不同膳食結(jié)構(gòu)對人體腸道微生物代謝影響，分析人體血糖、體重及相關(guān)微生物的變化情況，并分析具體原因。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

瓊脂糖凝膠：100 g，上海翊圣生物科技有限公司；

超微量分光光度計：NanoDrop 2000/2000C型，北京金業(yè)德祥科技有限公司；

ABIGeneAmp PCR儀：9700型，上海艾研生物科技有限公司；

AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒：Axygen-AP-GX-50 型，上海玉博生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗分組

(1) 人員分組：選擇120位志愿者參加試驗，任意將其劃分成高脂膳食結(jié)構(gòu)組、高糖膳食結(jié)構(gòu)組和高纖維膳食結(jié)構(gòu)組3組，針對每種膳食結(jié)構(gòu)受試者，隨機將其劃分成對照組和試驗組，每組20人。所有受試者均自愿參加試驗。

(2) 試驗時間：7周。

(3) 試驗食品：高脂膳食結(jié)構(gòu)試驗組將披薩、漢堡、牛奶巧克力、蛋糕、冰淇淋、油炸食品、糖果作為主要食物[8]；高糖膳食結(jié)構(gòu)試驗組將米飯、馬鈴薯、南瓜、西瓜、膨化零食、蜂蜜制品等作為主要食物；高纖維膳食結(jié)構(gòu)試驗組將谷物及制品、麥片、豆類及制品、蔬菜、菌類、堅果、水果及肉類作為主要食物。

對照組在試驗期間均衡飲食。

1.2.2 腸道微生物菌群變化及DNA提取 對兩組受試者新鮮糞便進(jìn)行采集，每次采集0.2 g左右，放在10 mL經(jīng)殺菌處理后的EP管中，通過無菌生理鹽水將糞便懸液10倍稀釋到合理的稀釋度，研究受試者糞便中乳酸桿菌、雙歧桿菌等腸道微生物的變化。對腸道微生物進(jìn)行培養(yǎng)，并采用平板菌落計數(shù)法對菌落進(jìn)行計數(shù)[10]，結(jié)果用每克糞便中細(xì)菌菌落數(shù)的對數(shù)值進(jìn)行描述。

依據(jù)試劑盒說明書對人體糞便細(xì)菌基因組總DNA進(jìn)行提取，同時完成對其的質(zhì)控檢測。通過1%瓊脂糖凝膠電泳對DNA的完整性進(jìn)行檢測，通過NanoDrop對OD260/280與OD260/230進(jìn)行檢測，同時求出DNA純度，OD260/280需處于1.8～2.0范圍內(nèi)，DNA濃度需超過50 ng/μL。將DNA樣本在冰上融化，充分混勻同時進(jìn)行離心處理[11]。

1.2.3 PCR擴增與產(chǎn)物純化 采用的PCR擴增部分是細(xì)菌16S rDNA的V3～V4區(qū)，選用通用引物338F與806R，20 μL 反應(yīng)體系[12]。PCR反應(yīng)在9700型ABI GeneAmp PCR儀上完成，為了提高測序結(jié)果的精確度與可靠度，需保證所有樣本PCR循環(huán)數(shù)相同，盡量選擇低循環(huán)數(shù)增加合理濃度。所有樣本做3個PCR重復(fù)后混合產(chǎn)物，通過2%瓊脂糖凝膠電泳對條帶尺寸及濃度是否合理進(jìn)行檢測。通過Axygen-AP-GX-50型的AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒切膠回收目的PCR條帶。

1.2.4 生物學(xué)指標(biāo)測試

(1) 體重：通過體重秤進(jìn)行測量。

(2) 血糖：通過血糖試紙檢測。

(3) PCR產(chǎn)物：通過Illumina Miseq高通量測序平臺完成高通量測序[13]，采集高質(zhì)量序列，對其生物學(xué)指標(biāo)進(jìn)行測試，主要包括操作單元聚類測試、腸道微生物多樣性測試。

(4) 操作單元聚類測試：對非重復(fù)序列進(jìn)行采集，通過QIIME研究系統(tǒng)完成對序列的生物信息學(xué)分析，和Silva數(shù)據(jù)庫中已有的16S rDNA序列相比，將相似性高于97%的序列合并在一起，產(chǎn)生分類操作單元OUT。

(5) 微生物多樣性測試：按照OUT聚類結(jié)果，完成alpha與beta多樣性求解，通過Ace、Chao1、Simpson、Shannon等指數(shù)進(jìn)行評估，其中Ace、Chao1用于實現(xiàn)微生物豐度評估，Simpson、Shannon用于描述多樣性評估。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

試驗數(shù)據(jù)均通過SPSS 11.5統(tǒng)計軟件完成分析，處理結(jié)果均以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)的形式描述。

2 結(jié)果與分析

2.1 高脂膳食結(jié)構(gòu)對人體及腸道微生物代謝的影響

2.1.1 高脂膳食結(jié)構(gòu)對體重的影響 由圖1可知，在試驗過程中，兩組受試者體重均有所升高，與對照組相比，高脂試驗組受試者體重增加情況更加明顯。第4周兩組受試者間的體重已經(jīng)存在顯著性差異(P<0.05)，到試驗完成的第6周，存在差異的膳食結(jié)構(gòu)對兩組受試者的體重產(chǎn)生了很大的影響，二者間體重存在極顯著性差異(P<0.01)，說明高脂膳食結(jié)構(gòu)能使人體體重增加。

*. 與對照組相比差異顯著(P<0.05) **. 與對照組相比差異極顯著(P<0.01)

圖1 試驗過程中受試者體重改變情況

Figure 1 Subject weight change during the trial

2.1.2 高脂試驗后腸道微生物DGGE圖譜情況 分析圖2 可以看出，高脂試驗組第4～6條帶及第9條帶信號在變?nèi)酰砻鞲咧攀辰Y(jié)構(gòu)造成上述腸道細(xì)菌個數(shù)逐漸降低。第7與第8號條帶在高脂對照組試驗后變淺，然而在高脂試驗組中變深，說明高脂膳食結(jié)構(gòu)可促進(jìn)相應(yīng)微生物在腸道中的代謝。剩余條帶只在高脂試驗組中出現(xiàn)，說明高脂膳食結(jié)構(gòu)可促進(jìn)相應(yīng)腸道微生物的代謝。

分析表1可知，完成試驗后，試驗組與對照組間腸道微生物DGGE圖譜中條帶個數(shù)、Shannon指數(shù)、均勻度和豐富度都明顯比對照組更高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，即試驗組受試者腸道微生物多樣性比對照組高。

2.2 高糖膳食結(jié)構(gòu)對人體腸道微生物代謝的影響

2.2.1 對體重的影響 分析表2可知，在試驗過程中，前4周，試驗組與對照組體重?zé)o顯著性差異(P>0.05)，后3周，試驗組受試者體重明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。第4周，試驗組受試者體重明顯高于對照組(P<0.05)，到試驗完成的第6周，二者間體重存在極顯著性差異(P<0.01)，說明高脂膳食結(jié)構(gòu)能使人體體重增加。

2.2.2 對血糖的影響 分析表3可知，對照組在試驗不同階段，除了初始血糖與第2周外，其余階段血糖值都比試驗組低，其中第7周試驗組血糖值顯著高于對照組(P<0.05)，說明高糖膳食結(jié)構(gòu)能夠令血糖值升高。在研究高糖膳食結(jié)構(gòu)對人體腸道微生物代謝的影響的過程中，發(fā)現(xiàn)試驗組受試者體重與血糖均較對照組顯著增加，說明高糖膳食結(jié)構(gòu)能夠使人體血糖增加，同時存在引起肥胖的危險。

1～11號條帶代表的腸道微生物依次是：緩慢葡萄球菌、小牛葡萄球菌、陰溝腸桿菌、費格森埃希菌、大腸桿菌、艾伯氏大腸桿菌、福氏志賀氏菌、楊氏檸檬酸桿菌、大腸桿菌、人口梭菌、扭動反芻球菌

圖2 對照組與高脂試驗組受試者腸道微生物DGGE圖譜

Figure 2 Intestinal microbial DGGE map of control group and high fat test group

2.2.3 對腸道微生物多樣性的影響 對糞便細(xì)菌基因進(jìn)行PCR擴增，完成高通量測序，得到的對照組與試驗組腸道微生物多樣性統(tǒng)計結(jié)果見表4。

表1 高脂對照組與高脂試驗組受試者腸道總微生物DGGE圖譜多樣性指數(shù)分析?

? *代表與對照組相比差異顯著(P<0.05)。

表2 試驗組和對照組試驗后體重比較?

? *代表與對照組相比差異顯著(P<0.05)；**代表與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。

表3 試驗組與對照組血糖比較結(jié)果?

? *代表與對照組相比差異顯著(P<0.05)。

表4 對照組與試驗組腸道微生物多樣性比較?

? *代表與對照組相比差異顯著(P<0.05)。

分析表4可以看出，對照組分類單元比試驗組多且差異顯著(P<0.05)，說明對照組多樣性高，測序深度覆蓋范圍指數(shù)均高于0.99，說明樣本中序列基本全部被檢測到。氣旋能量指數(shù)與菌種豐富度指數(shù)是微生物豐度的體現(xiàn)，試驗組氣旋能量指數(shù)與菌種豐富度指數(shù)均明顯低于試驗組(P<0.05)，說明試驗組腸道微生物豐富性低于對照組。對照組辛普森多樣性指數(shù)與香農(nóng)—威納指數(shù)比試驗組高，表明對照組受試者腸道微生物多樣性高于試驗組。

分析圖3可知，試驗組與對照組樣本腸道微生物均包含后壁菌門與擬桿菌門，并且包含變形菌門與脫鐵桿菌門，但含量低。比較兩組微生物組成可以看出，試驗組樣本厚壁菌門含量明顯高于對照組，而擬桿菌門含量明顯低于對照組。分析其原因，擬桿菌屬于不產(chǎn)生孢子、存在膽汁抗性的厭氧革蘭陰性桿菌，1 g健康人體糞便中擬桿菌規(guī)?？蛇_(dá)到3.2×1010個，占整個腸道微生物總量的25%左右[14]。擬桿菌主要負(fù)責(zé)吸收及降解多糖，主要為人體自身很難利用的植物多糖，增強人體營養(yǎng)利用率。

圖3 試驗組與對照組微生物分布情況

除此之外，擬桿菌還可提高腸黏膜血管產(chǎn)生率的功能。后壁菌門的偽榮球菌屬為革蘭陰性厭氧球菌，大部分存在于人體自然腔道中，糖類酵解能力差。變形菌門的脫氮硫桿菌為專性無機化能自養(yǎng)型微生物，利用卡爾文循環(huán)對二氧化碳進(jìn)行固定，在氧化時得到能量，同時將硝酸鹽當(dāng)成電子受體產(chǎn)生氮氣。

從人體糞便微生物群落豐度與結(jié)構(gòu)的角度分析，對照組受試者與試驗組受試者糞便菌群存在顯著不同，對照組受試者糞便中微生物豐度及多樣性高于試驗組，說明高糖膳食結(jié)構(gòu)不利于人體腸道微生物代謝。

2.3 高纖維膳食結(jié)構(gòu)對人體腸道微生物代謝的影響

研究[15]表明，遺傳、體力活動、環(huán)境和膳食均對人體肥胖產(chǎn)生很大的影響，高脂膳食結(jié)構(gòu)為引起肥胖的關(guān)鍵原因，而腸道微生物代謝在肥胖發(fā)展中起決定性作用。腸道微生物結(jié)構(gòu)和數(shù)量對人體健康有很大的影響，但因為腸道中大部分微生物當(dāng)前仍無法在實驗室中分離及培養(yǎng)，所以通過分子生態(tài)學(xué)方法對其進(jìn)行研究非常關(guān)鍵。

2.3.1 高纖維膳食結(jié)構(gòu)的DGGE圖譜比較 腸道有許多種微生物，例如：擬桿菌、脫氮硫桿菌、偽榮球菌等。本試驗以人體內(nèi)普遍存在的條帶A、B、C為例進(jìn)行分析，由圖4 可知，條帶數(shù)量以及豐度不但在不同組間存在差異，而且在同組的同一階段也存在差異。除此之外，試驗組受試者腸道微生物改變幅度相對較低，A、B微生物數(shù)量在一定程度上升高，C微生物數(shù)量無顯著改變。分析試驗組和對照組的腸道微生物結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)了明顯的改變，且豐富度、條帶數(shù)量、多樣性、均勻性均顯著增加(P<0.05)，說明高脂試驗組受試者腸道微生物類型可能比對照組多，這是因為高脂試驗組腸道內(nèi)細(xì)菌過渡生長，出現(xiàn)很多有害微生物，說明高脂膳食結(jié)構(gòu)會促進(jìn)人體腸道有害微生物的代謝。

圖4 試驗組與對照組腸道微生物DGGE圖譜

Figure 4 Intestinal microbial DGGE map of experimental group and control group

2.3.2 高纖維膳食結(jié)構(gòu)對腸道微生物多樣性比較 通過灰度分析軟件對圖4所示的DGGE圖像進(jìn)行分析，依據(jù)統(tǒng)計學(xué)理論獲取豐富度、多樣性和均勻性比較結(jié)果，用表5 進(jìn)行描述。

表5對照組與試驗組腸道微生物多樣性比較

Table5Comparisonofintestinalmicrobialdiversitybetweencontrolgroupandexperimentalgroup

組別豐富度香農(nóng)—威納指數(shù)均勻性對照組25.1±0.462.41±0.150.802±0.11試驗組24.6±0.702.26±0.420.811±0.09

分析表5可以看出，高纖維對照組與試驗組豐富度、香農(nóng)—威納指數(shù)與均勻性無顯著性差異。

對A、B、C 3條條帶進(jìn)行切膠與測序研究，同時和Silva數(shù)據(jù)庫(https://www.arb-silva.de)相比，發(fā)現(xiàn)微生物A屬于擬桿菌門，微生物B屬于后壁菌門，微生物C屬于變形菌門。隨著高纖維膳食結(jié)構(gòu)處理時間的增加，擬桿菌門以及后壁菌門數(shù)量在一定程度上有所升高，而變形菌門細(xì)菌數(shù)量無顯著改變。對上述試驗進(jìn)行分析，經(jīng)高纖維膳食結(jié)構(gòu)處理后，人體腸道擬桿菌與后壁菌門微生物數(shù)量都出現(xiàn)了顯著改變。本研究發(fā)現(xiàn)，受試者攝入高纖維膳食后，可促進(jìn)腸道有益細(xì)菌的繁殖，減少糖血脂與膽固醇的含量，調(diào)整機體代謝。然而如果食用高纖維膳食量過少，或者不食用，則腸道有害微生物的種類與數(shù)量會有所增加，特別是大腸桿菌、鏈球菌等。本研究表明，食用一段時間高纖維結(jié)構(gòu)膳食后，擬桿菌門與后壁菌門微生物含量有改變，說明高纖維飲食在很大程度上利用對上述靶細(xì)菌的調(diào)控發(fā)揮生理效應(yīng)，有助于人體腸道微生物代謝。

3 結(jié)論

本試驗以腸道中微生物后壁菌門、擬桿菌門為例，研究高脂膳食結(jié)構(gòu)、高糖膳食結(jié)構(gòu)和高纖維膳食結(jié)構(gòu)對腸道微生物代謝的影響，從微生物結(jié)構(gòu)的角度分析，高糖膳食結(jié)構(gòu)會促進(jìn)腸道有害微生物的代謝；高脂膳食結(jié)構(gòu)會使人體體重增加，對人體腸道微生物代謝造成影響，引起肥胖及高血壓、高血脂等疾病；而高纖維膳食結(jié)構(gòu)可促進(jìn)腸道有益細(xì)菌的繁殖，減少糖血脂與膽固醇的含量，調(diào)整機體代謝。

本研究僅分析不同膳食結(jié)構(gòu)對人體腸道微生物代謝的影響，未明確分析膳食中的哪種成分對應(yīng)哪些效果，今后將對此進(jìn)行深入研究。