李 麗，賈 琪，姚廣哲，歐陽慧子，常艷旭，何 俊

（1.天津中醫(yī)藥大學，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

香加皮為臨床常用中藥材，主要用于治療心力衰竭和風濕性關節(jié)炎，其化學成分主要為強心苷類、C21甾類、萜類，以及脂肪酸類。但是不合理使用后可能引起的惡心、嘔吐、腹瀉、心動過緩等諸多不良反應嚴重限制了其臨床應用。杠柳毒苷與杠柳次苷均為香加皮藥材中的甲型強心苷類成分[1]。杠柳毒苷作為香加皮主要有毒/有效成分，口服后可在體內發(fā)生代謝轉化，主要存在形式為杠柳次苷[2]。杠柳次苷具有強心、抗腫瘤等作用[3-6]，但同時也具有比杠柳毒苷更強的細胞毒性[7]。三七總皂苷是中藥三七的主要藥效物質，在維持血液循環(huán)、改善心腦血管、抗炎方面均顯示出一定的藥理作用[8]。研究表明，三七總皂苷與香加皮提取物或杠柳毒苷配伍后，均可降低杠柳毒苷產生的毒副作用[9]。本課題組在前期研究的基礎上[10]，考察了三七總皂苷對杠柳毒苷代謝產物杠柳次苷在大鼠體內藥動學的影響，初步揭示了香加皮、三七配伍減毒的作用機制，為臨床上香加皮、三七的配伍使用提供了理論依據。

1 材料

1.1 藥品與試劑 杠柳毒苷（批號：DST170907-041）、杠柳次苷（批號：DST170918-043）、三七總皂苷（批號：DST170815，人參皂苷 Rb1、Rd、Re、Rg1 和三七皂苷R1總量≥73.91%）購于成都德思特生物技術有限公司，補骨脂素（批號：180301-018）購于中國食品藥品檢定研究院，以上對照品（除杠柳毒苷外）質量分數(shù)均≥98%。

乙酸乙酯為分析純（天津康科德科技有限公司），甲醇、乙腈為色譜純（美國Fisher公司），色譜級甲酸（美國ROE公司），實驗用水為自制超純水。

1.2 儀器 Agilent6430三重四級桿串聯(lián)質譜儀（美國Agilent公司）；Agilent1200高效液相色譜儀（美國 Agilent公司）；5424R型高速離心機（德國eppendorf公司）；Milli-Q超純水制備儀（Millipore公司）；XPE205型十萬分之一天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）。

1.3 動物 清潔級雄性SD大鼠（220±30）g，動物許可證號：SCXK（京）2014-0004。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的配制

2.1.1 杠柳次苷標準溶液的配制 精密稱取杠柳次苷對照品9.99 mg，甲醇溶解于10 mL容量瓶中，稀釋至刻度，配制成濃度為0.999 mg/mL的儲備液，密封后置于4℃冰箱儲存?zhèn)溆?，待用時用甲醇依次稀釋，配制成杠柳次苷濃度為10~5 000 ng/mL的工作溶液。

2.1.2 內標溶液的配制 精密稱取補骨脂素10.01 mg，甲醇溶解于10 mL容量瓶中，稀釋至刻度，制備成濃度為1.001 mg/mL的儲備液，密封后置于4℃冰箱冷藏，待用時用甲醇稀釋成1μg/mL的內標（IS）溶液備用。

2.2 血漿樣品中杠柳次苷LC-MS/MS分析方法的建立

2.2.1 色譜條件 Waters CORTECSTM C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，2.7μm）；流動相：B 為乙腈，A 為0.1%甲酸水；流速0.3 mL/min，梯度洗脫（0~7 min，19%~50%B；7~9 min，50%~50%B）；柱溫為 30 ℃；進樣量5μL。

2.2.2 質譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），正離子檢測，檢測模式為多反應離子監(jiān)測（MRM）；干燥氣溫度：300℃；干燥氣流速：11 L/min；霧化器壓力：15 psi。杠柳次苷和補骨脂素的定量離子對分別為535.3→113.1和187.0→131.1；碎裂電壓分別為135 V和115 V；碰撞能量分別為20 V和25 V。

2.3 給藥方案及血漿樣品處理方法

2.3.1 給藥方案 將18只SD大鼠隨機分成3組，分別為：杠柳毒苷單獨給藥組、杠柳毒苷和低劑量三七總皂苷配伍組以及杠柳毒苷和高劑量三七總皂苷配伍組，每組6只。按杠柳毒苷10 mg/（kg·d）、三七總皂苷0.74 g/（kg·d）和2.22 g/（kg·d）（分別相當于香加皮與三七的配伍比例為1∶1和1∶3）的劑量灌胃給藥，分別給予杠柳毒苷和杠柳毒苷—三七總皂苷配伍溶液，連續(xù)給藥7 d。在給藥7 d后0、0.033、0.083、0.167、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h自大鼠眼眶靜脈叢采血0.25 mL，置于肝素化管中，以7 000 r/min，4℃離心，取上清得血漿，置于-70℃冰箱凍存。

2.3.2 血漿樣品處理方法 精密吸取血漿樣品100μL，定量加入內標補骨脂素（1μg/mL）20μL、甲醇20μL，渦旋1 min后，加入乙酸乙酯2 mL，渦旋5 min，離心 10 min（14 000 r/min）后，定量吸取上清液2 mL置于EP管中，氮氣吹干，殘渣加入50%甲醇 100 μL，渦旋 3 min，離心 10 min（14 000 r/min），取上清液在“2.2”條件下進行測定。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性 取大鼠空白血漿100μL（不加對照品溶液和內標）、空白血漿100μL加入杠柳次苷對照品及內標溶液、含藥血漿，按“2.3.2”項下處理，在2.2條件下測定，杠柳次苷和補骨脂素的保留時間分別是6.66 min和4.31 min，與血漿中內源性成分均能得到良好的分離，其他成分均無干擾，結果見圖1。

2.4.2 標準曲線及線性范圍 取“2.1”項下制得的不同濃度的對照品儲備液，加入到大鼠空白血漿中，按“2.3.2”項下的血漿樣品處理方法進行處理，配制成含杠柳次苷濃度分別為 2、4、10、20、50、200、800、1 000 ng/mL 的血漿樣品，在“2.2”條件下進行測定。以杠柳次苷的濃度（X）為橫坐標，杠柳次苷與補骨脂素的峰面積比值（Y?）為縱坐標進行加權最小二乘法回歸，獲得杠柳次苷的線性回歸方程及相關系數(shù)（Y?=0.179 249X+0.000 798 268 5，r=0.998 9）（權重系數(shù)為1/X），線性范圍為2~1 000 ng/mL，最低定量限為 0.5 ng/mL（S/N≥10）。

圖1 大鼠血漿中杠柳次苷（1）和內標（2）的MRM圖Fig.1 Extraction MRM chromatograms of periplocymarin（1）and IS（2）in plasma

2.4.3 精密度與準確度 依據杠柳次苷的線性范圍，取“2.1”項下制得的不同濃度的對照品儲備液，加入到大鼠空白血漿中，按照“2.3.2”項下方法進行處理，配制成含杠柳次苷終濃度為4、50和800 ng/mL的低、中、高3種濃度的質控樣品，3種溶液各6份，在“2.2”條件下連續(xù)測定3 d，并與標準曲線同時進行，記錄杠柳次苷在不同質控水平下的濃度，求得方法的日內精密度、日間精密度和準確度，結果見表1。

表1 杠柳次苷在大鼠血漿中的精密度及準確度Tab.1 Intra-day and inter-day precisions and accuracies of periplocymarin in rat plasma

2.4.4 回收率及基質效應 按照“2.3.2”項下方法配制杠柳次苷終濃度為4、50和800 ng/mL的質控樣品各6份，在“2.2”條件下進行分析測定，得到樣品峰面積（A1）后，將甲醇質控樣品按照“2.3.2”項下的方法進行處理后，在殘渣中加入100μL相應低、中、高3個濃度的杠柳次苷對照品溶液，在“2.2”條件下進行分析測定，得到峰面積（A2），則提取回收率計算公式為R=A1/A2×100%；在“2.2”條件下測定相應3個濃度的杠柳次苷對照品溶液，得到峰面積（A0）后，依據基質效應計算公式M=A2/A0可得杠柳次苷對照品溶液的基質效應；內標補骨脂素的提取回收率及基質效應計算方法同上。結果表明各成分的回收率及基質效應符合生物樣品分析要求，見表2。

表2 杠柳次苷和內標補骨脂素在大鼠血漿中的提取回收率和基質效應Tab.2 Recoveries and matrix effects of periplocymarin and IS in rat plasma

2.4.5 穩(wěn)定性考察 取100μL空白血漿，按“2.3.2”項下方法配制杠柳次苷終濃度為4、50和800 ng/mL 3種濃度的質控樣品，考察其在室溫下放置6 h再處理、-20℃反復凍融3次、血漿樣品處理后放置自動進樣器12 h和-70℃冰箱中冷凍14 d的穩(wěn)定性，血漿處理后按“2.2”項下條件進行分析，得到杠柳次苷RSD范圍為1.14%～11.12%。表明其穩(wěn)定性符合生物樣品分析要求，見表3。

2.5 藥動學結果 對A、B、C 3組血漿樣品中杠柳次苷的血藥濃度進行LC-MS/MS分析測定，得到杠柳次苷的平均血藥濃度-時間曲線，見圖2。將測得的各時間點的杠柳次苷血藥濃度以DAS 1.0軟件進行處理，杠柳次苷在大鼠體內的各項藥動學參數(shù)見表4。所得實驗數(shù)據經SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，得到A、B、C 3組間的藥動學參數(shù)差異。

3 結果與討論

對比分析3個給藥組中杠柳毒苷代謝產物杠柳次苷的藥動學參數(shù)可以看出：杠柳毒苷和三七總皂苷配伍后，配伍組中杠柳次苷的藥代動力學行為發(fā)生了明顯變化，具體表現(xiàn)為：配伍后杠柳次苷的Cmax較配伍前顯著降低（P＜0.05），而 Tmax則顯著升高（P＜0.05）；經高劑量三七總皂苷配伍后杠柳次苷的AUC0-t和 AUC0-∞較配伍前顯著降低（P＜0.01）。

表3 杠柳次苷在不同條件下的穩(wěn)定性Tab.3 Stability of periplocymarin in rat plasma

表4 不同組大鼠灌胃給藥后杠柳次苷的主要藥動學參數(shù)Tab.4 Pharmacokinetic parameters of periplocymarin in different groups

圖2 大鼠灌胃給藥后血漿中杠柳次苷的藥-時曲線（x±s，n=6）Fig.2 Mean plasma concentration-time curve of periplocymarin in rats after oral administration（x±s，n=6）

本課題組前期研究表明，隨著三七總皂苷配伍比例的增大，杠柳毒苷的藥動學參數(shù)Cmax、AUC0-t和AUC0-∞值呈現(xiàn)遞減趨勢[10]。據此分析，三七總皂苷可能通過影響杠柳毒苷在大鼠體內的代謝，從而使其代謝產物杠柳次苷的藥代動力學行為發(fā)生改變。