蘇 婷 ,宋殿榮,郭 潔 ,張 崴 ,陳然然
(1.天津中醫(yī)藥大學(xué),天津 301617;2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,天津 300150)
隨著人類平均壽命的延長(zhǎng),絕經(jīng)人口比例日益增加,絕經(jīng)問(wèn)題日趨凸顯,絕經(jīng)綜合征是絕經(jīng)相關(guān)的最常見(jiàn)疾病,涉及人體多個(gè)系統(tǒng)、多個(gè)器官,其癥狀表現(xiàn)多樣[1]。雌激素缺乏在許多癥狀的病因?qū)W中起主要作用,從而導(dǎo)致了許多慢性和老化性的疾病如骨質(zhì)疏松癥、心血管疾病和泌尿生殖道萎縮。在陰道組織中雌激素缺乏導(dǎo)致陰道黏膜萎縮,陰道上皮變薄,皺褶消失,陰道潤(rùn)滑作用下降[2-3]。雌激素通過(guò)雌激素受體(ER)發(fā)揮生物學(xué)作用,以前的研究已經(jīng)證明在陰道壁中存在ER,但對(duì)ER在陰道組織中的表達(dá)情況國(guó)內(nèi)外存在爭(zhēng)議。
在組織中ER的表達(dá)水平不同,組織對(duì)雌激素的反應(yīng)可能不同,了解受體亞型的表達(dá)水平可以更好地理解雌激素對(duì)泌尿生殖道的作用,并可針對(duì)特定的亞型治療泌尿生殖道疾病。因此,本研究擬探討不同絕經(jīng)時(shí)期婦女ER亞型在陰道組織中的表達(dá),為絕經(jīng)泌尿生殖道疾病的治療提供基礎(chǔ)證據(jù)。
1.1 研究對(duì)象 選取2016年11月—2017年11月天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科因良性疾病行陰式或腹式全子宮切除術(shù)的61例患者納入本研究,分為育齡期(月經(jīng)周期規(guī)律)24例、圍絕經(jīng)期(月經(jīng)周期長(zhǎng)度可變性持續(xù)增加,近10個(gè)月經(jīng)周期中反復(fù)出現(xiàn)相鄰周期提前或延后≥7 d,或月經(jīng)周期間隔>60 d)18例,絕經(jīng)后期(末次月經(jīng)后停經(jīng)≥12個(gè)月)19例,所有研究對(duì)象術(shù)前半年內(nèi)未服用過(guò)類固醇激素類藥物。本研究經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并取得患者及家屬知情同意。
1.2 研究方法
1.2.1 標(biāo)本采集 每例樣本取足夠的陰道壁組織,沿前穹窿環(huán)向取陰道前壁全層組織2份,大小均為0.8×0.8×0.8 cm3;一份用 4%多聚甲醛固定 24~48 h,常規(guī)石蠟包埋待檢,另一份立即放入RNAlater后轉(zhuǎn)運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室置-80℃冰箱凍存用于實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)分析標(biāo)本。
1.2.2 qPCR檢測(cè)陰道組織中ERα、ERβmRNA表達(dá) 用Trizol法提取總RNA,紫外分光光度法測(cè)定RNA的濃度及純度,甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性,High-capacity cDNAreverse transcription kits(invitrogen)將 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為模板 cDNA,應(yīng)用熒光定量PCR儀(美國(guó)BIO-RAD)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(SYBR Green MIX購(gòu)自DBI公司)目的基因,實(shí)驗(yàn)所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成,引物序列及其產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1。
表1 qPCR引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度Tab.1 qPCR primer sequences and product length
1.2.3 免疫組化法(IHC)檢測(cè)陰道組織中ERα、ERβ蛋白表達(dá) 將1.2.1中獲得的陰道壁組織石蠟包埋后切片,厚度約3~5μm,將組織切片附于經(jīng)多聚賴氨酸附膜的載玻片上,60℃烘烤過(guò)夜;二甲苯脫蠟,1%甲醇雙氧水滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,將切片浸泡在0.01 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液中,放入微波爐內(nèi)高火熱修復(fù)抗原10 min;0.1 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次×5 min,切片上滴加正常山羊血清封閉液,室溫靜置20 min,滴加第一抗體(所有抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司),4℃過(guò)夜,PBS洗 3次×5 min,滴加第二抗體,37℃,20 min,PBS洗3次×5 min,DAB顯色,蘇木素復(fù)染細(xì)胞核1 min,將IHC染色切片置于顯微鏡100、400倍下觀察,陽(yáng)性染色為細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。隨機(jī)選取每張切片中的5個(gè)視野,每個(gè)視野中各計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,計(jì)算陽(yáng)性率。參考Soslow等[4]文獻(xiàn)進(jìn)行評(píng)分,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):1)陽(yáng)性細(xì)胞百分比對(duì)應(yīng)的值:陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)0為0分,1%~10%為1分,11%~50%為2分,51%~80%為3分,81%~100%為4分。2)陽(yáng)性細(xì)胞顯色強(qiáng)度分級(jí)0為陰性,1為弱陽(yáng)性,2為陽(yáng)性,3為強(qiáng)陽(yáng)性。IHS=陽(yáng)性細(xì)胞顯色強(qiáng)度×陽(yáng)性細(xì)胞百分比對(duì)應(yīng)值。
1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,多組均數(shù)的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),兩兩比較采用SNK法。以α=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 qPCR檢測(cè)陰道組織中ERα、ERβmRNA表達(dá) qPCR結(jié)果分析,與育齡期組相比,圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后婦女陰道組織中ERαmRNA表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);同時(shí)絕經(jīng)后婦女陰道組織中ERαmRNA表達(dá)低于圍絕經(jīng)期組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與育齡期組相比,圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后婦女陰道組織中ERβmRNA表達(dá)高于育齡期組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);同時(shí)絕經(jīng)后婦女陰道組織中ERβmRNA表達(dá)高于圍絕經(jīng)期組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2。
表2 ERα、ERβmRNA相對(duì)定量qPCR結(jié)果(x±s)Tab.2 Relative quantitative qPCR results of ERαand ERβ mRNA(x±s)
2.2 檢測(cè)陰道組織中ERα、ERβ蛋白表達(dá) IHC結(jié)果分析,ERα和ERβ兩種受體均表達(dá)于細(xì)胞核,呈棕黃色顆粒,見(jiàn)圖1。與育齡期組相比,圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后婦女陰道組織中ERα蛋白表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);同時(shí)絕經(jīng)后婦女陰道組織中ERα蛋白表達(dá)低于圍絕經(jīng)期組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與育齡期組相比,圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后婦女陰道組織中ERβ蛋白表達(dá)高于育齡期組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);同時(shí)絕經(jīng)后婦女陰道組織中ERβ蛋白表達(dá)高于圍絕經(jīng)期組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表3。
雌激素是女性重要的生殖激素,雌激素生物學(xué)作用的發(fā)揮需要特異性、高親和力的ER介導(dǎo)[5-7],在人類細(xì)胞中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了兩種經(jīng)典的ER亞型,即ERα和ERβ。研究表明[8-9],ERα和ERβ具有幾乎相同的DNA結(jié)合域,但其配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出很大的差異,并且兩者在參與靶基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的N-末端區(qū)域也有很大差異,導(dǎo)致兩種受體與化合物的親和力不同,表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性不同,不同組織中兩種受體亞型的表達(dá)水平不同,因此不同的ER配體組織選擇性作用不同。
關(guān)于不同絕經(jīng)時(shí)期陰道組織中ERα、ERβ的分布及含量變化,兩種受體亞型介導(dǎo)雌激素生物效應(yīng)的作用差異研究結(jié)果不一致。如Chen等[10]發(fā)現(xiàn)ERα和ERβ均存在于絕經(jīng)前婦女的陰道壁組織中,但絕經(jīng)后婦女陰道壁中ERβ的表達(dá)缺失。Perez等[11]發(fā)現(xiàn),絕經(jīng)后陰道組織中ER與血清中雌激素呈負(fù)相關(guān),但ER與絕經(jīng)的時(shí)間表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性,隨著絕經(jīng)時(shí)間的延長(zhǎng),ER在逐漸增加。Skala等[12]研究ERα、ERβ在陰道壁組織中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)ERα在絕經(jīng)后明顯升高,ERβ在絕經(jīng)后明顯降低。Fu等[13]研究表明,絕經(jīng)后婦女陰道壁組織中ERα的表達(dá)水平顯著下降,激素替代療法治療后能明顯升高ERα的表達(dá),無(wú)論有無(wú)激素替代治療ERβ的表達(dá)水平在絕經(jīng)前后未見(jiàn)明顯變化。
圖1 ERα、ERβ免疫組化染色結(jié)果Fig.1 Result of ERαand ERβimmunohistochemical staining
表3 ERα、ERβ蛋白IHS結(jié)果(x±s)Tab.3 r ESULTS of ERα,ERβ protein IHS(x±s)
而本研究結(jié)果表明,ERα和ERβ在育齡期、圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后婦女陰道組織中均有表達(dá),但表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式,圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后婦女陰道組織中ERα的表達(dá)水平較育齡期婦女顯著下降,而且隨著年齡的增長(zhǎng)及絕經(jīng)年限的延長(zhǎng),絕經(jīng)后婦女陰道組織中ERα的表達(dá)水平較圍絕經(jīng)期婦女顯著下降,但圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后婦女陰道組織中ERβ的表達(dá)水平較育齡期婦女顯著升高,而且絕經(jīng)后婦女陰道組織中ERβ的表達(dá)水平高于圍絕經(jīng)期,說(shuō)明絕經(jīng)影響陰道組織中ER的表達(dá)。本研究結(jié)果與Fu等人研究基本一致,ERα在所有婦女的陰道壁組織中均有表達(dá),絕經(jīng)后ERα的表達(dá)降低且與絕經(jīng)時(shí)間表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性,隨著絕經(jīng)時(shí)間延長(zhǎng),ERα的表達(dá)大幅度下降;Fu等研究表明,ERβ在絕經(jīng)前后均有表達(dá),但表達(dá)未見(jiàn)明顯差異,本研究也證明ERβ在絕經(jīng)前后婦女陰道組織中有表達(dá),然而,表達(dá)似乎受到絕經(jīng)的影響。上述研究結(jié)果不一致的原因考慮與年齡、絕經(jīng)年限、研究方法有關(guān),正如Ewies等[14]描述不同絕經(jīng)時(shí)期和陰道脫垂均影響陰道組織中ER的表達(dá)。
本實(shí)驗(yàn)揭示了不同絕經(jīng)時(shí)期患者陰道組織中ERα和ERβ的表達(dá)形式不同,說(shuō)明兩者在介導(dǎo)雌激素作用方面有不同的功能,是造成雌激素作用的組織特異性的物質(zhì)基礎(chǔ),了解不同絕經(jīng)狀態(tài)患者陰道組織中ER的表達(dá)變化,可針對(duì)特定的受體亞型治療絕經(jīng)后婦女泌尿生殖道疾患,為絕經(jīng)后婦女泌尿生殖道疾患的雌激素治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。