羅浩，劉四清

（川北醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，綿陽(yáng) 621000）

卵巢癌是女性生殖器官常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，卵巢癌的病死率在各類婦科腫瘤中較高。核因子－κB（NF-κB）是核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它在調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，一般情況下，NF-κB在細(xì)胞胞漿中沒(méi)有活性，當(dāng)化療藥物、射線等因素刺激時(shí)，即發(fā)生磷酸化、泛素化，NF-κB隨之活化并轉(zhuǎn)位入核，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。目前，已有學(xué)者［1，2］提出 NF-κB及其信號(hào)通路是腫瘤治療的一個(gè)策略。為此，本研究擬探討NF－κB通道的激活及其與腫瘤血管形成的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集本院2008年～2014年卵巢癌患者47例，年齡25～75歲?；颊呔邮芰寺殉睬谐g(shù)，且均為首次發(fā)病，未接受過(guò)化療、放療及藥物治療?；颊咝g(shù)后行病理檢測(cè)，Ⅰ期組12例，Ⅱ期組20例，Ⅲ/Ⅳ期組15例，另選正常卵巢20例為對(duì)照組。所有患者在我院手術(shù)室切取標(biāo)本后，立即在腫瘤組織處取1 cm×1cm×1cm大小組織塊。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與器材

NF-κB抗體、IL-2抗體、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）抗體、SABC免疫組化染色試劑盒和DAB顯色試劑盒等（所有試劑均購(gòu)于上海研卉生物科技有限公司），Olympus光學(xué)顯微鏡、光學(xué)顯微鏡照相系統(tǒng)和Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)等。

1.3 免疫組織化學(xué)方法（SABC）測(cè)定 NF－κB、IL-2和VEGF的表達(dá)

采用SABC法，步驟簡(jiǎn)述如下：1）切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育5～10min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性；2）蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min；3）用山羊血清封閉液封閉，室溫孵育10min，倒去血清，0.02%PBS漂洗5min×3次；4）滴加一抗，其中P-JAK2（1∶500）、P-STAT3（1∶350）于4℃冰箱過(guò)夜，0.02%PBS漂洗5min×3次，再用PBS取代一抗用作空白對(duì)照；5）加入二抗，室溫孵育20min，0.02%PBS漂洗5min×3次；6）滴加試劑SABC（1∶100），室溫孵育2h，0.02%PBS漂洗5min×3次；7）DAB染色；8）自來(lái)水沖洗，蘇木素輕度復(fù)染，然后進(jìn)行脫水、透明和封片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Image-Pro Plus 5.0軟件分析 NF－κB、IL-2和VEGF蛋白陽(yáng)性表達(dá)的累積光密度值（IOD），并計(jì)算平均值，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間均數(shù)兩兩比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，取檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌組織中 NF－κB、VEGF和IL-2蛋白的表達(dá)

對(duì)照組可見(jiàn)少量NF－κB、VEGF和IL-2蛋白的表達(dá)；與對(duì)照組比較，Ⅰ期組、Ⅱ期組和Ⅲ/Ⅳ期組NF-κB、VEGF和IL-2表達(dá)均增多（P＜0.05）；與Ⅰ期組比較，Ⅱ期組和Ⅲ/Ⅳ期組NF－κB、VEGF表達(dá)均增多（P＜0.05），IL-2表達(dá)均減少（P＜0.05）；與Ⅱ期組比較，Ⅲ/Ⅳ期組NF－κB、VEGF表達(dá)增多（P＜0.05），IL-2表達(dá)均減少（P＜0.05）（見(jiàn)表1、圖1）。

表1 各組NF-κB、VEGF和IL-2蛋白的表達(dá)（±s）

與對(duì)照組比較，▲P＜0.05；與Ⅰ期組比較，★P＜0.05；與Ⅱ期組比較，●P＜0.05

20 0.75±0.14 1.47±0.69 0.62±0.29Ⅰ期組 12 35.79±1.99▲ 30.92±2.07▲ 54.39±2.63▲Ⅱ期組 20 64.94±1.09▲★ 48.20±4.31▲★ 41.84±2.29▲★Ⅲ/Ⅳ期組 15 85.08±1.39▲★● 65.67±3.12▲★● 20.51±1.65 B VEGF IL-2對(duì)照組分組 n NF-κ▲★●

2.2 Ⅰ期組、Ⅱ期組和Ⅲ/Ⅳ期組NF-κB與VEGF、IL-2表達(dá)的相關(guān)分析

Ⅰ期組、Ⅱ期組和Ⅲ/Ⅳ期組NF-κB與VEGF呈正相關(guān)（r＝0.845，r＝0.763，r＝0.819，P＜0.05），與IL-2呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.634，r＝-0.781，r＝-0.598，P＜0.05）。

3 討論

NF-κB是由大鼠B淋巴細(xì)胞核提取的一種能與免疫球蛋白K輕鏈增強(qiáng)子κB序列（GGGACTTTCC）特異性結(jié)合的核蛋白因子，它由NF-κB1（p50）、NF-κB2（p52）、RelB、RelA（p65）和c-Rel（Rel）組 成，其 中 NF－κB1 基 因 編 碼 NF－κB1（p50），NF-κB2基因編碼 NF-κB2（p52），RelA 基因編碼 RelA（p65），REL基因編碼c-Rel。NF-κB家族可分為兩類：1）含轉(zhuǎn)錄激活的區(qū)域，它可正向調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，包括p65（RelA）、c-Rel（Rel）、RelB；2）不含轉(zhuǎn)錄激活的區(qū)域，它的二聚體可抑制轉(zhuǎn)錄，包括NF-κB1（p50）、NF-κB2（p52）。NF-κB 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子在細(xì)胞的生存、增殖、分化和凋亡，蛋白酶的降解，免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和應(yīng)激反應(yīng)以及氧化還原反應(yīng)等方面 有轉(zhuǎn)錄 調(diào)節(jié)作 用［3－6］。通 常情況下，NF-κB與IκB或DNA結(jié)合為二聚體而存在，當(dāng)多種因素刺激時(shí)，如細(xì)胞因子、病毒、雙鏈ANA、氧化劑、細(xì)菌脂多糖、多種抗原和紫外線照射等，通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑使IκB磷酸化，然后通過(guò)蛋白水解酶作用發(fā)生降解，使NF－κB活化發(fā)揮調(diào)控作用［7］。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示：Ⅰ期組、Ⅱ期組和Ⅲ/Ⅳ期組NF－κB的表達(dá)均較對(duì)照組增多（P＜0.05），說(shuō)明卵巢癌患者瘤組織內(nèi)NF－κB通道被激活；Ⅱ期組和Ⅲ/Ⅳ期組NF－κB的表達(dá)均較Ⅰ期組增多（P＜0.05），Ⅲ/Ⅳ期組NF-κB的表達(dá)較Ⅱ期組增多（P＜0.05），說(shuō)明卵巢癌患者越到后期，NF-κB通道的表達(dá)越活躍。

圖1 免疫組化法檢測(cè) NF-κB、VEGF、IL-2蛋白的表達(dá)

國(guó)內(nèi)外學(xué) 者［8，9］研究表 明，NF-κB 對(duì)血管 的 形成有重要調(diào)節(jié)作用。常見(jiàn)的血管生長(zhǎng)因子有堿性成纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、酸性成纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子、VEGF、血管生成素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α和β、腫瘤壞死因子α、血小板來(lái)源的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、粒細(xì)胞集落刺激因子、胎盤(pán)生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞介素-8、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和增殖素等。血管抑制因子有血管抑素、內(nèi)皮抑素、血小板因子-4、凝血栓蛋白、金屬蛋白酶組織抑制劑、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、干擾素、胎盤(pán)增殖素相關(guān)蛋白、催乳素、bFGF溶解性受體蛋白、IL-2和可容性 VEGF受體（flt-1）等［10］。本實(shí)驗(yàn)研究表明：1）Ⅰ期組、Ⅱ期組和Ⅲ/Ⅳ期組的VEGF、IL-2表達(dá)較對(duì)照組均增多（P＜0.05），說(shuō)明卵巢癌組織中有血管的形成。2）Ⅱ期組和Ⅲ/Ⅳ期組VEGF的表達(dá)均較Ⅰ期組增多（P＜0.05），IL-2的表達(dá)較Ⅰ期組均減少（P＜0.05）；Ⅲ/Ⅳ期組VEGF的表達(dá)較Ⅱ期組增多（P＜0.05），IL-2的表達(dá)較Ⅱ期組均減少（P＜0.05），說(shuō)明卵巢癌組織中血管生長(zhǎng)因子越到后期表達(dá)越多，而血管抑制因子越到后期表達(dá)越少。3）Ⅰ期組、Ⅱ期組和Ⅲ/Ⅳ期組NF－κB與 VEGF呈正相關(guān)（P＜0.05），與IL-2呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），說(shuō)明卵巢癌相關(guān)蛋白 NF-κB可通過(guò)上調(diào)VEGF的表達(dá)及下調(diào)IL-2的表達(dá)共同調(diào)節(jié)腫瘤血管的生成。

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