許 航，王海久，姚丹華，李幼生*，樊海寧*

(1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽胰外科，青海 西寧 810000；2.青海省包蟲病研究重點實驗室，青海 西寧 810000；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院普外科，上海 200011)

and the concentration of IFN-γ and IL-6 in the supernatantof IEC-6 by MTT

如今，越來越多關(guān)于維生素D在腸道中的生理作用被人們所重視。由于維生素D的生物學(xué)作用都是通過維生素D受體(Vitamin D receptor，VDR)來實現(xiàn)的，活性維生素D可以激活VDR，因此我們認(rèn)為活性維生素D的作用等同于VDR的作用。近幾年來的研究發(fā)現(xiàn)，VDR是一個胃腸道的保護(hù)性受體，并廣泛分布于人體各個器官，具有抗炎作用[1]。動物實驗證實，小腸切除術(shù)后，在膳食中添加維生素D，可以促進(jìn)隱窩的分化和腸上皮細(xì)胞的增殖[2]，也可以維持腸上皮細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)[3]。同時，VDR下調(diào)可以減輕大鼠結(jié)腸炎癥[4]。但目前維生素D對緩解腸道炎癥的具體機(jī)制不明，因此，本實驗通過體外建立LPS誘導(dǎo)的大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞IEC-6炎癥模型，觀察VDR對該模型的影響，探究其可能存在的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

IEC-6 細(xì)胞購于富衡生物公司；培養(yǎng)用胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)購于Gibco公司；DMEM培養(yǎng)基、胰酶、脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)、1，25二羥維生素D3(1，25-dihydroxy-vitamin D3，1，25D3)購于Sigma公司；INF-γ、IL-6 ELISA試劑盒購于聯(lián)科生物；RNA提取試劑盒GeneJET RNA Purification Kit購于Thermo公司；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Takara公司；PowerUp SYBR Master Mix購于ABI公司；RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度定量試劑盒購于代軒生物公司；Claudin-1一抗購于Abcam公司；Occludin一抗購于Novus公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將IEC-6細(xì)胞放在10% FBS的DMEM培養(yǎng)基(37℃，5%CO2，濕潤)上培養(yǎng)，每兩天傳代1次。

1.2.2 實驗細(xì)胞分組及干預(yù)

取生長良好的IEC-6細(xì)胞做如下分組：空白對照組(normal control，NC組)；LPS組；1nM-1，25D3+ LPS組(1nM組)，10nM-1，25D3+ LPS組(10nM組)；100nM-1，25D3+ LPS組(100nM組)；200nM-1，25D3+ LPS組(200nM組)；500nM-1，25D3+ LPS 組(500nM組)?？瞻讓φ战M正常培養(yǎng)，其余各組分別用0、1、10、100、200、500nM的1，25D3預(yù)處理72 h，之后加入LPS，使LPS總濃度達(dá)到10 mg/L，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞及上清液進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.3 MTT實驗

將預(yù)先接種到96孔板中并處理過的各組細(xì)胞，加入20 μL MTT，孵育4 h后用移液器吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加150 μL DMSO。

用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測定各孔的吸光值。

1.2.4 炎癥因子檢測

吸取各組細(xì)胞上清液至1.5 mL EP管中，離心(12000g)5 min去除細(xì)胞碎片，然后吸取1 mL細(xì)胞上清液至新的1.5 mL EP管中，后續(xù)按照ELISA試劑盒說明書檢測炎癥因子INF-γ、IL-6。

1.2.5 實時熒光定量PCR實驗

提取細(xì)胞的總RNA，測定其濃度，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，反應(yīng)總體系為Total RNA 500 ng、5×PrimeScript RT Master Mix 2 μL，補(bǔ)充RNase Free dH2O至10 μL。進(jìn)行實時熒光定量PCR實驗，反應(yīng)總體系為：2× PowerUp SYBR Green Master Mix 5 μL，正向引物和反向引物濃度為500nM，cDNA模板10 ng，補(bǔ)充ddH2O至10 μL。引物見表1。

表1 PCR引物Table1 PCR primer

1.2.6 Western blot 實驗

用RIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白，用BCA法測定濃度；之后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉封閉過夜(4℃)。室溫孵育一抗抗體Claudin-1、Occludin和內(nèi)參抗體GAPDH 2 h，洗膜。室溫孵育二抗抗體2 h，洗膜，加入顯影液后在顯影儀器中曝光顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 用MTT法檢測細(xì)胞生長情況

與空白對照組相比，加入LPS處理24 h的各組細(xì)胞存活率均有不同程度下降。在不同濃度1，25D3預(yù)處理的各組細(xì)胞間隨著預(yù)處理1，25D3濃度的增加，細(xì)胞存活率呈現(xiàn)梯度增長趨勢。見表2。

表2 細(xì)胞平均存活率及ELISA實驗檢測細(xì)胞上清中IFN-γ和IL-6濃度結(jié)果 Table2 Detection of the cell survival rate of IEC-6 by MTT experiment

#：與NC組比較，P<0.05；*：與LPS組比較，P<0.05；▲：與1nM組比較P<0.05；△：與10nM組比較，P<0.05；◆：與100nM組比較，P<0.05

2.2 用ELISA法檢測細(xì)胞上清液中IL-6、IFN-γ表達(dá)情況

與空白對照組相比，LPS組細(xì)胞上清液中的IFN-γ和IL-6濃度顯著上升(P<0.05)。用不同濃度1，25D3預(yù)處理72 h之后的各組細(xì)胞的上清液中IFN-γ和IL-6的濃度隨著預(yù)處理1，25D3濃度的上升而逐漸下降，到達(dá)500nM后不再下降。見表2。

2.3 用實時熒光定量PCR情況

用LPS處理后，1，25D3預(yù)處理與未預(yù)處理各組間VDR、TLR4、MyD88、NF-κB mRNA的表達(dá)情況見表3。表3顯示，TLR4、MyD88、NF-κB mRNA的表達(dá)水平經(jīng)LPS刺激24 h后顯著增高(P<0.05)。

表3 VDR、TLR 4、NF-κB、MyD 88 mRNA的相對表達(dá)量 Table3 mRNA relative expression of

#：與NC組比較，P<0.05；*：與LPS組比較，P<0.05；▲：與1nM組比較，P<0.05；△：與10nM組比較，P<0.05；◆：與100nM組比較，P<0.05

2.4 緊密連接蛋白的Western blot結(jié)果

結(jié)果顯示，LPS組緊密連接蛋白Occudin和Claudin-1較空白對照組表達(dá)減弱，200nM組緊密連接蛋白較LPS組表達(dá)有所增強(qiáng)。見圖1。

1：LPS組；2：200nM組；3：空白對照組
圖1Occludin和Claudin-1蛋白表達(dá)圖
Figure1The expression of Occludin and Claudin-1protein

3 討論

本實驗結(jié)果顯示，在IEC-6細(xì)胞中，VDR可以通過抑制TLR4/NF-κΒ 信號通路，減少NF-κΒ的表達(dá)，從而減輕腸道炎癥反應(yīng)，保護(hù)腸粘膜。

炎癥因子是反應(yīng)炎癥程度的重要指標(biāo)，MTT實驗可以反映細(xì)胞活力。因此本研究在體外用LPS誘導(dǎo)IEC-6細(xì)胞后，通過測量細(xì)胞上清中炎癥因子濃度和細(xì)胞活力來驗證體外炎癥模型是否成功。實驗結(jié)果顯示，用LPS誘導(dǎo)IEC-6細(xì)胞成功建立了細(xì)胞炎癥模型。之后，用1，25D3按照濃度從1nM至500nM預(yù)處理72 h，VDR mRNA呈現(xiàn)出梯度增加的趨勢。隨著VDR的上調(diào)，炎癥反應(yīng)得到了抑制，表現(xiàn)在ICE-6細(xì)胞分泌的相關(guān)炎癥因子IFN-γ、IL-6以及TLR4/NK-κB信號通路上相關(guān)mRNA較空白對照組顯著下降，并且細(xì)胞存活率上升。而在不同濃度1，25D3的處理下，根據(jù)濃度梯度，呈現(xiàn)出規(guī)律性變化。本實驗觀察到，隨著1，25D3預(yù)處理濃度上升，對TLR4信號通路的抑制程度逐漸加強(qiáng)。到500nM后，與200nM相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。我們認(rèn)為，200nM是對IEC-6細(xì)胞的最適濃度。在幼建鯉腸道細(xì)胞中，給予1～200 pM 1，25D3，可以調(diào)節(jié)TLR4/NF-κΒ 信號通路，抑制LPS誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[5]。而在SKCO15細(xì)胞中，5～40nM 1，25D3可以保護(hù)緊密連接蛋白[6]。因此，在不同細(xì)胞中，1，25D3的有效濃度不同。

維生素D有抑制炎癥反應(yīng)的作用。已有實驗證實維生素D在炎癥性結(jié)腸癌細(xì)胞模型中減輕炎癥的作用是通過TLR4通路介導(dǎo)的[7]。而VDR的減少會增加炎癥風(fēng)險[8]，也會導(dǎo)致緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin等的破壞[9，10]，其機(jī)制是炎癥反應(yīng)激活了TLR4/NF-κB信號通路[11]，破壞了腸屏障功能。在血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥模型中，上調(diào)VDR可以抑制炎癥[12]。在潰瘍性結(jié)腸炎的病人血清中，活性維生素D的濃度與炎癥程度呈負(fù)相關(guān)[13]。在許多文獻(xiàn)中也指出，VDR在NF-κB信號通路[14]和腸粘膜屏障的保護(hù)中有著至關(guān)重要的作用[15]，這與本研究中所示緊密連接蛋白Occludin和Claudin-1表達(dá)情況相符。

綜上所述，本實驗初步證實了在IEC-6細(xì)胞中通過上調(diào)VDR，抑制了MyD88依賴的TLR4/NF-κB信號通路，減輕了炎癥反應(yīng)，從而保護(hù)了腸粘膜屏障。本研究仍有一些不足之處，首先，只在IEC-6細(xì)胞中做了相關(guān)干預(yù)，這不能證明VDR在其他腸道上皮細(xì)胞中也有相同的作用；其次，只對VDR進(jìn)行了上調(diào)，沒有對VDR進(jìn)行沉默。