張紅波 李前瓊 呂雪鳳

【摘要】目的：建立靈芝養(yǎng)肝丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用顯微鑒別法對(duì)豬苓、大黃、赤芍、黃連、厚樸、甘草進(jìn)行鑒別，用薄層色譜法對(duì)大黃、黃連進(jìn)行鑒別;用高效液相色譜法測(cè)定赤芍中芍藥苷的含量。結(jié)果：薄層色譜斑點(diǎn)清晰;芍藥苷在0.06～1.8μg（r=0.9999）的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為98.41%（n=6），RSD為0.63%。方法精密度，重復(fù)性符合要求。結(jié)論：該方法結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于靈芝養(yǎng)肝丸的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】靈芝養(yǎng)肝丸;薄層色譜法;高效液相色譜法;質(zhì)量控制

【中圖分類號(hào)】R284【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【文章編號(hào)】1007-8517（2019）8-0054-04

Abstract：ObjectiveToestablishthequalitystandardofGanodermalucidumliverpill.MethodsLingling，rhubarb，radixpaeoniae，Huanglian，Magnoliaandlicoricewereidentifiedbymicroscopicidentification，andrhubarbandHuanglianwereidentifiedbyTLC，andthecontentofPaeoniflorininRadixpaeoniaewasdeterminedbyhighperformanceliquidchromatography.ResultsTLCspotswereclear，thelinearrelationshipbetweenPaeoniflorinwasgoodintherangeof0.06～1.8μg（r=0.9999），theaveragerecoveryratewas97.98%（n=6），andtheRSDwas1.86%.MethodPrecision，repeatabilitymeettherequirements.ConclusionTheresultsofthismethodareaccurateandreliable，anditissuitableforthequalitycontrolofGanodermalucidumliverpill.

Keywords：GanodermaLucidumLiverPill;TLC;HighPerformanceLiquidChromatography;QualityControl

靈芝養(yǎng)肝丸為萊蕪市中醫(yī)醫(yī)院制劑品種，具有疏肝利膽、行氣化濕的功效，適用于脂肪肝、乙肝、膽系感染等癥。靈芝養(yǎng)肝丸由17味藥組成，組方復(fù)雜，原批準(zhǔn)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較簡(jiǎn)單，達(dá)不到控制質(zhì)量的目的。為了更好的控制藥品質(zhì)量，增加了對(duì)組方中豬苓、大黃、赤芍、黃連、厚樸、甘草的顯微鑒別，大黃、黃連的薄層色譜鑒別和高效液相色譜法測(cè)定赤芍中芍藥苷的含量，從而較全面的反應(yīng)包括投料在內(nèi)的質(zhì)量控制指標(biāo)。

1儀器與材料

1.1儀器ShimadzuLC-20A高效液相色譜處理系統(tǒng)（日本）;梅特勒-托利多XS105DU電子分析天平（瑞士）;科哲生化薄層色譜成像系統(tǒng);KQ-250DE超聲波清洗器;BX-51奧林巴斯顯微鏡。

1.2材料靈芝養(yǎng)肝丸（批號(hào)：180524、180607、180620，萊蕪市中醫(yī)醫(yī)院）;大黃（批號(hào)：120902-201311）;黃連（批號(hào)：120913-201611）;芍藥苷（批號(hào)：110736-201842）對(duì)照藥材與對(duì)照品均為中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1顯微情況取本品適量，用水溶散，取沉淀物共裝10個(gè)載玻片置顯微鏡下觀察：菌絲散在或黏結(jié)成團(tuán)，無色或淡棕色，細(xì)長(zhǎng)，稍彎曲，有分枝（靈芝）。菌絲間有草酸鈣方晶，大多呈正方八面體形等（豬苓）。草酸鈣簇晶大，直徑60～140μm（大黃）。導(dǎo)管群放射狀排列，導(dǎo)管旁有木纖維（赤芍）。石細(xì)胞鮮黃色，單個(gè)或成群散在（黃連）。石細(xì)胞分支狀，壁厚，層紋明顯（厚樸）。纖維束周圍薄壁細(xì)胞含草酸鈣方晶，形成晶纖維（甘草）。如圖1～7所示。

2.2薄層鑒別

2.2.1大黃的TLC鑒別取本品0.6g，加甲醇20mL，浸漬1h，濾過，取濾液5mL，蒸干，殘?jiān)铀?mL溶解，再加鹽酸0.5mL，置水浴上加熱30min，立即冷卻，用乙醚20mL，分2次（10mL、10mL）振搖提取，合并乙醚提取液，蒸干，殘?jiān)尤燃淄?mL使溶解，作為供試品溶液。再取大黃對(duì)照藥材0.1g，同法制成對(duì)照藥材溶液。另取處方中除去大黃的其他藥味，按處方比例制成缺大黃的陰性對(duì)照樣品。取陰性對(duì)照樣品2g，同供試品溶液的制法，制成陰性對(duì)照溶液。分別取上述3種溶液各4μL，分別點(diǎn)在硅膠G薄層板上，石油醚（30～60℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的5個(gè)橙色熒光斑點(diǎn);置氨蒸氣中熏后，日光下檢視，顯相同的紅色斑點(diǎn)。陰性對(duì)照在相應(yīng)位置沒有斑點(diǎn)，表明陰性對(duì)照無干擾。如圖8～9所示。

2.2.2黃連的TLC鑒別本品1g剪碎，加甲醇5mL，超聲處理15min，濾過，濾液作為供試品溶液。再取黃連對(duì)照藥材0.25g，同法制成對(duì)照藥材溶液。另取處方中除去黃連的其他藥味，按處方比例制成缺黃連的陰性對(duì)照樣品。取陰性對(duì)照樣品2g，同供試品溶液的制法，制成陰性對(duì)照溶液。分別取上述三種溶液各2μL。分別點(diǎn)在硅膠G薄層板上，甲苯-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水（6∶3∶1.5∶2∶0.3）為展開劑，在另槽中加入等體積的濃氨試液，預(yù)平衡15min，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。陰性對(duì)照在相應(yīng)位置沒有斑點(diǎn)，表明陰性對(duì)照無干擾。如圖10所示。

2.3含量測(cè)定

2.3.1色譜的條件C18色譜柱（4.6mm×150mm，5μm）;流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86）;速度：1.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm;進(jìn)樣量：10μL。理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.3.2制備對(duì)照品溶液取芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含60μg的溶液，即得。

2.3.3制備供試品溶液取本品10丸，剪碎，稱取5g，精密稱定，加入等量硅藻土，研細(xì)，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50mL，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率50kHz）30min，取出，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4制備陰性對(duì)照溶液按處方比例制成不加赤芍藥材的陰性樣品，按照供試品溶液方法2.3.3制成陰性對(duì)照溶液。

2.4方法學(xué)的考察

2.4.1線性范圍分別精密吸取濃度為0.06mg/mL的芍藥苷溶液各2、5、10、15、20、30μL，注入液相色譜儀，分別測(cè)定峰面積積分值。以對(duì)照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，對(duì)照品峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：y=88224x-8993.3，相關(guān)系數(shù)r=0.9999。試驗(yàn)結(jié)果表明，芍藥苷進(jìn)樣量在0.06～1.8μg之間進(jìn)樣量與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2儀器精密度試驗(yàn)精密吸取芍藥苷對(duì)照品溶液（0.06mg/mL）5μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)其峰面積積分值。結(jié)果RSD為0.19%，表明儀器精密度良好。

2.4.3樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)取樣品（180524）照上述方法實(shí)驗(yàn)。每隔5h進(jìn)樣1次，每次5μL，測(cè)定芍藥苷的峰面積積分值，共5次，結(jié)果RSD為0.50%，表明供試品溶液在25h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4方法重復(fù)性考察取同一批號(hào)（批號(hào)：180607）的樣品6份，按2.3.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算含量與RSD，結(jié)果表明，靈芝養(yǎng)肝丸供試品中芍藥苷的含量為0.93mg/g。RSD為1.89%，表明含量測(cè)定方法的重復(fù)性良好。

2.4.5加樣回收率試驗(yàn)取已測(cè)知含量的本品適量（批號(hào)：180607，芍藥苷的含量為0.93mg/g），剪碎，取約2.5g，精密稱定，加入等量硅藻土，研細(xì)，置具塞錐形瓶中，精密加入芍藥苷對(duì)照品溶液（濃度為：0.06mg/ml）40mL、甲醇10mL，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率50kHz）30min，取出，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各5μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算。結(jié)果表明，測(cè)定方法的回收率良好。見表1。

2.4.6專屬性試驗(yàn)將對(duì)照品溶液、樣品溶液及陰性對(duì)照溶液，依次進(jìn)行測(cè)定，按照“2.3.1”設(shè)定的色譜條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。圖譜表明：陰性對(duì)照無相應(yīng)色譜峰，可認(rèn)為在此方法下該樣品中其他組成部分對(duì)實(shí)驗(yàn)沒有影響。結(jié)果如圖11～13所示。

2.5樣品測(cè)定取3批樣品，按“2.3.3”項(xiàng)下方法得到的樣品溶液，按照預(yù)設(shè)的條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)所得的峰面積得到樣品中芍藥苷的含量。結(jié)果見表2。

3討論

實(shí)驗(yàn)參考藥典方法[1]，分別采用顯微鑒別法對(duì)豬苓、大黃、赤芍、黃連、厚樸、甘草進(jìn)行鑒別，各品種特征明顯可見。用高效液相色譜法測(cè)定赤芍中芍藥苷的含量，參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-9]，采用高效液相色譜法測(cè)定了赤芍中芍藥苷的含量?？疾炝税步輦?200、島津LC-20A兩種儀器和InertsilODS-3（4.6mm×150mm，5μm）;Agilent5TC-C18（4.6mm×150mm，5m）;AgilentEclipseXDB-C18（4.6mm×150mm，5μm）3種色譜柱的影響。兩種儀器和上述3種柱子由計(jì)算所得可知實(shí)驗(yàn)?zāi)陀眯詽M足要求，該方法操作簡(jiǎn)便，樣品中芍藥苷峰與雜質(zhì)峰完全分離，分析時(shí)間短，重現(xiàn)性良好。

根據(jù)相關(guān)資料[2-5]，進(jìn)行大黃、黃連的薄層色譜法適用性試驗(yàn)，考察了不同的溫濕度（16℃、26℃，32%、65%、88%）和薄層板（Merck、青島海洋、煙臺(tái)大學(xué)科工所、自制板），均得到了滿意結(jié)果。該方法適用于靈芝養(yǎng)肝丸的測(cè)定。

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（收稿日期：2019-02-11編輯：陶希睿）