安佰義 王迦 王嫚 于慧穎 范愛淇 張艷波 張艷 李鋒

摘要：以李18個(gè)品種種質(zhì)資源為試驗(yàn)材料，對(duì)其開展ISSR反應(yīng)體系引物篩選，結(jié)果表明，從41個(gè)隨機(jī)引物中篩選出25個(gè)多態(tài)性引物用于PCR擴(kuò)增，每個(gè)多態(tài)性引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)在8～23條之間，擴(kuò)增出的DNA片段長度大多在150～2 400 bp 之間;共擴(kuò)增出條帶數(shù)為385條，其中，樣品間相同的條帶數(shù)有53條;所選引物的多態(tài)位點(diǎn)百分率為86.23%。

關(guān)鍵詞：李;種質(zhì)資源;ISSR;引物;多態(tài)位點(diǎn)

中圖分類號(hào)： S662.302.4? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）10-0063-03

區(qū)間簡單重復(fù)序列標(biāo)記（inter-simple sequence repeat，ISSR）是一種微衛(wèi)星基礎(chǔ)上的第2代分子標(biāo)記技術(shù)，其基本原理是用錨定的微衛(wèi)星DNA為引物，在簡單重復(fù)序列（SSR）的3′端或5′端各加2～4個(gè)非重復(fù)隨機(jī)核苷酸序列作為引物，在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）中錨定引物可引起特定位點(diǎn)退火，并對(duì)重復(fù)序列間的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增[1-3]。ISSR標(biāo)記結(jié)合了隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（RAPD）、SSR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，具有模板DNA用量少、引物設(shè)計(jì)簡單、成本低、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性豐富、產(chǎn)物重復(fù)性和穩(wěn)定性好、試驗(yàn)安全性較高及技術(shù)難度較低等特點(diǎn)[4]，現(xiàn)已在植物遺傳作圖、基因定位、品種鑒定、遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析等方面被廣泛應(yīng)用[5-9]。

我國是李的起源地之一，有著非常豐富的李種質(zhì)資源，是李種質(zhì)遺傳多樣性中心[10]。李是優(yōu)良的蜜源植物，其葉簇、花朵、果實(shí)有一定的觀賞價(jià)值，可作庭園綠化樹種[11]。中國李對(duì)土壤要求不嚴(yán)格，適應(yīng)性好，生長迅速，結(jié)實(shí)期早，產(chǎn)量高，抗灰腐病力強(qiáng)，果實(shí)耐貯藏，被世界各國引種栽培，并作為培育李的重要親本，而在長期選育過程中，李的親緣關(guān)系復(fù)雜[12]。本試驗(yàn)對(duì)李種質(zhì)資源基因組進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，以期篩選出擴(kuò)增良好的引物，對(duì)李種質(zhì)資源親緣關(guān)系的鑒定及研究能提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

18份李種質(zhì)資源，由國家果樹種質(zhì)公主嶺寒地果樹資源圃提供，試驗(yàn)編號(hào)及種質(zhì)名稱見表1。試驗(yàn)引物共41個(gè)（表2），參照哥倫比亞大學(xué)公布的ISSR引物序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 植物基因組DNA的提取

采用十二烷基苯磺酸鈉（SDS）法提取植物基因組DNA。2016年5月，自李樹剛萌發(fā)的新梢上采集幼嫩葉片 液氮速凍，置于-80 ℃冰箱中保存，備用;取適量葉片，液氮條件下研磨至粉末狀，裝于2 mL離心管，加入Buffer A提取液，立即混勻;65 ℃水浴16 min，其間搖動(dòng)離心管2次;取出離心管，冷卻至室溫，加入體積比為25 ∶ 24 ∶ 1的酚、三氯甲烷、異戊醇混合液800 μL，輕輕搖勻2～3 min;12 000 r/min離心 8 min，上清轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，盡量不要觸動(dòng)中間蛋白層;加入 0.7 倍體積的異丙醇至上清液中，輕輕混勻，直至絮狀沉淀產(chǎn)生;用毛細(xì)管勾出絮狀沉淀，轉(zhuǎn)移至裝有200 μL 70%乙醇的1.5 mL離心管中進(jìn)行洗滌;吸干離心管中乙醇，DNA在管中自然晾干;加入200 μL含RNA酶的1×TE緩沖液以充分溶解DNA，4 ℃或-20 ℃保存，備用。

1.3 PCR擴(kuò)增與電泳檢測

反應(yīng)體系總體積為10 μL，分別為10×上樣緩沖液（loading buffer）1 μL，2.5 mmol/L dNTP 0.2 μL，0.4 μmol/L引物（Primer） 0.4 μL，5 U/μL Taq酶0.1 μL，50 ng/μL DNA模板2 μL，用雙蒸水補(bǔ)足10 μL。擴(kuò)增程序參照文獻(xiàn)[12]，并稍作修改，95 ℃預(yù)變性4 min;95 ℃變性30 s，45～61 ℃退火 45 s（退火溫度見表2），72 ℃延伸2 min，共34個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物4 ℃保存，經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳液為1×TAE緩沖液，DL 2000為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，電壓為135 V，電泳時(shí)間為50 min;電泳結(jié)果采用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄，每個(gè)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物呈穩(wěn)定而清晰的條帶作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，有條帶的記為“1”，無條帶的記為“0”;將數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)，對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

由圖1、圖2、圖3可見，不同的生物基因組可使用同1個(gè)引物，而對(duì)某一特定的基因組，不同引物的擴(kuò)增效率是不同的，引物擴(kuò)增效率的高低由其產(chǎn)生的多態(tài)性條帶數(shù)決定。由表3可見，41個(gè)引物中可篩選出25個(gè)多態(tài)性高的引物用于擴(kuò)增，這25條引物分別為UBC807、UBC810、UBC811、UBC812、UBC815、UBC818、UBC821、UBC825、UBC827、UBC834、UBC835、UBC836、UBC841、UBC842、UBC843、UBC844、UBC845、UBC846、UBC847、UBC848、UBC856、UBC857、UBC859、UBC873、UBC881;25個(gè)多態(tài)性引物對(duì)18份李種質(zhì)資源進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出的條帶數(shù)在8～23條之間，擴(kuò)增出的分子量大多在150～2 400 bp之間;共擴(kuò)增出條帶數(shù)為385條，其中樣品間相同的條帶數(shù)有53條，呈多態(tài)性的條帶數(shù)為332條，平均多態(tài)位點(diǎn)百分率為86.23%;擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶占比在55.56%～100.00%之間，其中，引物UBC812、UBC815、UBC821、UBC844、UBC848、UBC881擴(kuò)增出的條帶多態(tài)性相對(duì)較好，多態(tài)性條帶占比達(dá)到100.00%。

3 結(jié)論與討論

目前，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)李種質(zhì)資源的研究已取得較大進(jìn)展。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)具有操作簡單、可靠性強(qiáng)、重復(fù)性高等特點(diǎn)，但運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)時(shí)，每個(gè)引物在不同物種上的擴(kuò)增效率不同，引物的多態(tài)性水平越高，則說明物種的種質(zhì)資源越豐富。因此，針對(duì)不同物種篩選出條帶清晰、穩(wěn)定性高的引物是必不可少的[13]。本試驗(yàn)篩選出的引物多態(tài)性程度相對(duì)較高，平均多態(tài)位點(diǎn)百分率為86.23%，說明李種質(zhì)資源的遺傳基礎(chǔ)較為廣泛，種質(zhì)資源較為豐富，這可能與我國是李屬植物的起源中心且自然分布較廣有關(guān);從41個(gè)引物中篩選出的25個(gè)引物能夠很好地反映出供試?yán)罘N質(zhì)資源的差異性，擴(kuò)增出的條帶多態(tài)性占比在55.56%～100%之間，其中，引物UBC812、UBC815、UBC821、UBC844、UBC848、UBC881擴(kuò)增出的條帶可用于多態(tài)性標(biāo)記，與劉威生等的研究結(jié)果[9，14]基本一致。