丁煜哲 田 坤

（西安高新第一中學 陜西西安 710000）

1 引出問題

鹽代謝紊亂是目前公認的對心腦血管和腎臟產(chǎn)生損害，是引起冠心病、中風和腎衰竭等的重要風險因子［1-2］，人們選擇降低食鹽的攝入量，以減少鹽代謝紊亂可能帶來的疾病風險。然而，在已有的細胞與動物研究中，食鹽的使用濃度非常寬泛（20～160 mmol／L）［3-5］，高濃度食鹽的使用會引起研究系統(tǒng)內(nèi)的滲透壓改變，從而過高評估食鹽所帶來的危害。如何選取合理的食鹽刺激與給予濃度，是正確評估食鹽毒性的關鍵因素。本項目利用人血管內(nèi)皮細胞系（HUVEC），對比了不同鹽濃度刺激下的細胞形態(tài)改變與細胞凋亡情況，證明了選擇合理鹽濃度刺激的重要性；同時根據(jù)篩選的最優(yōu)鹽濃度，檢測了在該濃度刺激條件下，食鹽對細胞活力、增殖以及凋亡的影響。食鹽的主要成分是氯化鈉，為了便于控制濃度，本文選用分析純的氯化鈉作為食鹽用于之后的研究中。

2 實驗材料與方法

2.1 實驗材料 HUVEC 細胞系購于上海生命科學院菌種保存中心；氯化鈉、蔗糖等試劑購于國藥集團；Cell Counting Kit-8 細胞增殖試劑盒及Annexin-V&PI 細胞凋亡試劑盒購于碧云天生物科技有限公司；主要科研平臺借助西安交通大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學系實驗室。

2.2 實驗方法

2.2.1 倒置顯微鏡細胞形態(tài)觀察 以1×105個／孔為濃度，將細胞接種于12 孔細胞培養(yǎng)板，同時給予不同濃度（0 mmol／L、20 mmol／L、40 mmol／L、60 mmol／L、80 mmol／L 和160 mmol／L）的食鹽刺激，分別培養(yǎng)12 h、24 h、48 h 和72 h 進行觀察、拍照。

2.2.2 Countstar 細胞活力評估 以1×105個/孔為濃度，將細胞接種于12 孔細胞培養(yǎng)板，分別給予60 mmol／L蔗糖和60 mmol／L 氯化鈉刺激，24 h 后胰酶消化收集細胞，用0.4%臺盼藍染色后，5 min 內(nèi)在Countstar 自動細胞計數(shù)儀分析。

2.2.3 CCK-8細胞增殖以1×104個/孔為濃度，漿細胞接種于96 孔細胞培養(yǎng)板，分別給予60 mmol／L蔗糖和60 mmol/L氯化鈉刺激，在培養(yǎng)0 h、24 h、48 h 和72 h 后 加 入10 μL 的CCK-8染色，37℃孵育1 h 后，在酶標儀中用450 nm 波長測定吸光度。

2.2.4 Annexin-V&PI 流式檢測細胞凋亡 以1×105個/孔為濃度，將細胞接種于12 孔細胞培養(yǎng)板，分別給予60 mmol/L 蔗糖和60 mmol／L 氯化鈉刺激，72 h 后胰酶消化收集細胞，離心后棄去上清液，加入200 μL Binding Buffer，充分混勻，再加入10 μL Annexin V-FITC，以及5 μL PI 輕輕混勻避光，置于4℃下反應30 min，1 h 內(nèi)流式上機檢測。

3 實驗結果

3.1 不同鹽濃度刺激下的細胞形態(tài)變化 根據(jù)文獻中經(jīng)常使用的鹽濃度，筆者選擇了0 mmol／L、20 mmol／L、40 mmol／L、60 mmol／L、80 mmol／L 和160 mmol／L 作為刺激條件，觀察不同時間刺激后，HUVEC 細胞形態(tài)發(fā)生的變化。主要基于高濃度的食鹽刺激，必然引起細胞的失水，細胞形態(tài)會發(fā)生較大的變化，結果如下圖1所示。細胞在160 mmol／L 的鹽刺激條件下，細胞生長在各個時間點都受到明顯抑制，細胞形態(tài)不均一，推測可能出現(xiàn)凋亡與壞死；80 mmol／L 的鹽刺激條件下，細胞生長在72 h 稍微出現(xiàn)抑制，而形態(tài)改變并不明顯；在其余濃度與時間點，細胞形態(tài)與生長密度都沒有明顯異常。

圖1 不同濃度氯化鈉刺激的細胞形態(tài)學觀察（200×）

3.2 不同鹽濃度刺激下的細胞凋亡情況 根據(jù)食鹽高濃度刺激下的細胞狀態(tài)，筆者推測細胞可能已處于凋亡或壞死狀態(tài)，為此，通過流式細胞術Annexin-V 和PI 的共染，證明此時的細胞凋亡與壞死情況，結果如圖2（見封四）所示。

根據(jù)圖2所示，細胞在160 mmol／L和80 mmol／L的2 個點都出現(xiàn)了大幅度的細胞凋亡與壞死，說明此時的細胞是由于滲透壓改變出現(xiàn)的整體性凋亡與壞死，而其余濃度下細胞凋亡與壞死并不顯著。需要強調(diào)的是，因為HUVEC 屬于貼壁細胞，胰酶消化會造成部分細胞的凋亡與壞死，所以對照中盡管沒有食鹽刺激，但還是有少許的凋亡與壞死存在。結合圖1 和圖2，筆者認為60 mmol／L 是一個比較理想的刺激濃度，一方面保證了較高的食鹽濃度，另一方面并不因滲透壓的改變而對細胞造成整體性影響。之后的實驗中選擇該濃度為最適的食鹽刺激濃度。

圖2 不同鹽濃度刺激下的細胞凋亡與壞死情況（200×）

3.3 60 mmol／L 食鹽刺激下的細胞活力 在確定了適合的鹽濃度后，該濃度的食鹽刺激會對細胞活力有何影響？除了選擇60 mmol／L 的食鹽刺激，在對照組中加入了同樣濃度的蔗糖，以排除可能的微小的滲透壓影響，結果如圖3 和表1所示。

圖3 蔗糖和氯化鈉最優(yōu)刺激濃度下細胞經(jīng)臺盼藍染色后結果比較（200×）

表1 60 mmol／L 蔗糖與氯化鈉刺激下的細胞活力參數(shù)

根據(jù)圖3 和表1 的結果，相比較于60 mmol／L的蔗糖刺激，氯化鈉對于細胞的活力的影響非常有限，經(jīng)臺盼藍染色后，2 組細胞間的差異不大，只有微小的細胞活率降低，而細胞直徑、平均圓度等都不受影響。

3.4 60 mmol／L 食鹽刺激下的細胞增殖 在觀察了細胞形態(tài)，檢測細胞凋亡與細胞活力后，利用CCK-8 試劑盒檢測了60 mmol／L 氯化鈉對HUVEC 細胞增殖的影響，同樣選擇60 mmol／L 的蔗糖作為對照，按照實驗方法介紹的步驟，獲得了12 h、24 h、48 h 和72 h 的光吸收值，根據(jù)光吸收值的大小，說明細胞的增殖情況，結果如圖4所示。

根據(jù)圖4 結果，發(fā)現(xiàn)在72 h 時氯化鈉刺激組表現(xiàn)出明顯的細胞增殖抑制，而在其他時間點并未出現(xiàn)，說明氯化鈉對細胞增殖的影響是需要一定時間積累才會出現(xiàn)，也證實食鹽的毒害作用可能隨著時間的推移逐步積累。

圖4 最優(yōu)濃度下氯化鈉對細胞增殖的影響

4 實驗討論

本項目作為一個高中生研究性的學習案例，在關注食鹽對內(nèi)皮細胞損傷研究時發(fā)現(xiàn)，以往的課題研究在食鹽濃度的選擇上非常寬泛，考慮到滲透壓改變可能會帶來細胞生長的致命性損害，盡管食鹽本身也能帶來滲透壓的損害，但這種損害是在一定程度內(nèi)，人類也可以通過增加攝水調(diào)整食鹽濃度，但過高鹽濃度使用結論會誤導大眾對食鹽毒性的認識，且過度的降低食鹽攝取同樣危害健康；同時為了尋找最優(yōu)的食鹽作用濃度，本項目通過對細胞形態(tài)觀察，細胞活力、增殖和凋亡的檢測證明60 mmol／L 是一個比較理想的食鹽作用濃度。本項目能解決研究食鹽對內(nèi)皮細胞損傷研究時在選擇合理食鹽濃度的困惑，但是食鹽對機體的影響是復雜的，不僅限于內(nèi)皮細胞，機體是一個復雜的網(wǎng)絡互做模式，之后還需要更為深入的研究；同時對于參與項目學習的高中生而言，對于滲透壓，以及細胞生長、增殖、凋亡的研究也有利于加強對這些概念的理解。