劉雅清 杜 娟 徐 娟

（華東師范大學(xué)第二附屬中學(xué)附屬初級(jí)中學(xué) 上海 200241）

“青霉菌培養(yǎng)與觀察”是《上海市中學(xué)生生命科學(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)》初中階段主題3“生物的主要類群”中“微生物”部分的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。教材中提供的培養(yǎng)青霉菌的方法是將新鮮橘皮置于溫暖、潮濕的環(huán)境培養(yǎng)1 周左右，橘皮上長(zhǎng)出的青綠色的菌落即為觀察對(duì)象。利用該培養(yǎng)方法得到的青霉菌往往過于成熟，很難找到基內(nèi)菌絲或營(yíng)養(yǎng)菌絲及產(chǎn)孢子結(jié)構(gòu)共存的最佳視野，往往看到的都是高密度散落的綠色孢子。在青霉菌的觀察方法上，教材中指導(dǎo)學(xué)生利用解剖針或者鑷子挑取少許菌絲放在水滴中，制成臨時(shí)裝片在顯微鏡下觀察。而此觀察方法對(duì)學(xué)生的操作技術(shù)要求較高，且孢子很容易散落，較難觀察到完整的青霉菌產(chǎn)孢子結(jié)構(gòu)。

為了解決上述培養(yǎng)、觀察青霉菌方法中存在的問題，本實(shí)驗(yàn)對(duì)青霉菌的培養(yǎng)和觀察方法進(jìn)行了改進(jìn)。首先，觀察用的青霉菌皆來源于利用PDA 培養(yǎng)基在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)所得的培養(yǎng)平板，利用PDA 培養(yǎng)基極大縮短了青霉菌的培養(yǎng)時(shí)間，經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)也得到了觀察青霉菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的最優(yōu)培養(yǎng)時(shí)間。其次，優(yōu)化了制作青霉菌臨時(shí)裝片的方法，采用透明膠帶粘附法使學(xué)生較易制得目標(biāo)裝片，并觀察到完整的青霉菌結(jié)構(gòu)，降低了實(shí)驗(yàn)操作難度，縮短了實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間。最后，全部的實(shí)驗(yàn)操作過程中，青霉菌始終生長(zhǎng)在培養(yǎng)皿基質(zhì)內(nèi)，避免了霉菌孢子散落在空氣中被學(xué)生吸入而引發(fā)身體不適，并且也方便實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的菌種保藏和霉菌處理。

1 實(shí)驗(yàn)材料

土豆、紗布、葡萄糖、橘皮培養(yǎng)的青霉菌原始菌種、涂布棒、無菌水、無菌平皿、顯微鏡、載玻片、蓋玻片、透明膠帶、剪刀、鑷子、吸水紙、紗布等。

實(shí)驗(yàn)環(huán)境：顯微數(shù)碼互動(dòng)實(shí)驗(yàn)室。

2 青霉菌的培養(yǎng)

2.1 PDA 培養(yǎng)基的配制 土豆洗凈去皮切成小塊,稱取200 g 加水煮爛（煮沸20 min，能被玻璃棒戳破即可）。用8 層紗布過濾，濾液中加入20 g葡萄糖，攪拌均勻，再補(bǔ)足水分至1 L，分裝錐形瓶。按照1.5%～2%的比例稱量瓊脂并分裝到錐形瓶中，加塞、包扎，115℃滅菌30 min，搖勻，冷卻至55℃左右倒平板，備用。

2.2 青霉菌的接種 在超凈工作臺(tái)中，用滅菌后的涂布棒將橘皮上的青霉菌原始菌種轉(zhuǎn)到裝有20 mL 無菌水的平皿中，混勻制成孢子液；利用涂布棒將上述制得的菌液接種到若干PDA 固體平板中。

2.3 青霉菌的培養(yǎng)條件 將接種好的青霉菌固體平板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 h，培養(yǎng)箱內(nèi)保持一定濕度。具體培養(yǎng)時(shí)間以青霉菌長(zhǎng)勢(shì)情況為準(zhǔn)，最佳長(zhǎng)勢(shì)為白色菌落上剛剛呈現(xiàn)出綠點(diǎn)，此時(shí)終止培養(yǎng)并置于冰箱冷藏備用。由于青霉菌在冷藏狀態(tài)下仍然保持低速繁殖的模式，所以冷藏備用的時(shí)間不能超過48 h。

2.4 青霉菌菌種保藏方法 待培養(yǎng)皿中青霉菌菌落成熟后（綠色菌落），用保鮮膜或者封口膜包扎好置于冰箱冷藏，可保存數(shù)年，使用前取出轉(zhuǎn)接新配制的PDA 培養(yǎng)基活化即可［1］。

3 青霉菌的顯微觀察

3.1 臨時(shí)裝片的制作 剪一條1～2 cm 長(zhǎng)的透明膠帶，輕輕沾取青霉菌培養(yǎng)皿中略帶有綠色孢子的白色菌絲部分（切勿用手按壓膠帶），將沾有青霉菌的膠帶粘在載玻片上。沾取青霉菌后立即蓋好培養(yǎng)皿蓋，以防吸入大量孢子。

3.2 顯微觀察方法 將臨時(shí)裝片置于顯微鏡載物臺(tái)上，在10 倍物鏡下尋找?guī)в小皰咧恪睒拥那嗝咕a(chǎn)孢子結(jié)構(gòu)的物像，將該物像調(diào)至視野中央，換40 倍物鏡觀察。

3.3 觀察結(jié)果呈現(xiàn)

圖1 青霉菌顯微圖像（10×40 倍）

圖1 為10×40 倍放大倍數(shù)下青霉菌的顯微圖像，可以清楚地觀察到完整的“掃帚”樣產(chǎn)孢子結(jié)構(gòu)及直立的分生孢子梗，且能追蹤到“掃帚”樣產(chǎn)孢子結(jié)構(gòu)頂端即將散落和已經(jīng)散落的分生孢子。

4 教學(xué)效果討論

從學(xué)生觀察到的青霉菌顯微圖像結(jié)果呈現(xiàn)來看，視野中能清晰地看到青霉菌“掃帚”樣產(chǎn)孢子結(jié)構(gòu)及直立的分生孢子梗，且能追蹤到“掃帚”樣產(chǎn)孢子結(jié)構(gòu)頂端成串的成熟孢子即將散落的過程，幫助學(xué)生更好地理解為什么操作過程中要盡量避免空氣流通，以防吸入大量孢子。青霉菌在固體培養(yǎng)基中要經(jīng)歷3 個(gè)生長(zhǎng)階段：第1 階段是基內(nèi)菌絲和氣生菌絲的生長(zhǎng)；第2 階段在氣生菌絲上長(zhǎng)出直立的分生孢子梗，繼而在分生孢子梗頂端形成成串的孢子，此結(jié)構(gòu)即為顯微鏡下能觀察到的“掃帚”樣產(chǎn)孢子結(jié)構(gòu)；第3 階段孢子會(huì)大量繁殖，密集地覆蓋在氣生菌絲上［2］。觀察青霉菌的最佳時(shí)期是當(dāng)青霉菌生長(zhǎng)至第2 階段初期，此時(shí)在直立的分生孢子梗的頂端剛好形成成串的孢子，進(jìn)行顯微觀察時(shí)視野中有大范圍能夠鎖定目標(biāo)的觀察物，而此階段經(jīng)歷的時(shí)間非常短，僅停留幾小時(shí)［1］，所以優(yōu)化青霉菌的培養(yǎng)是非常必要的，本實(shí)驗(yàn)很好地解決了該問題。

本實(shí)驗(yàn)在青霉菌的觀察方法上做了改進(jìn)，利用膠帶粘附的方法大幅降低了學(xué)生操作的難度，使其有充足的時(shí)間觀察菌絲和產(chǎn)孢子結(jié)構(gòu)，從上述結(jié)果呈現(xiàn)來看實(shí)驗(yàn)效果很好。同時(shí)，膠帶粘附法可以將菌體生長(zhǎng)的狀態(tài)完好地保留下來，避免了因青霉菌孢子在制作裝片過程中的散落而影響觀察效果。