陳玉糧

（揚州大學，江蘇 揚州225009）

1 巨大芽孢桿菌BM1259 的研究進展

巨大芽孢桿菌是芽孢桿菌屬，屬于好氧革蘭氏陽性桿菌，是一種有益菌，具有對環(huán)境和人畜無害等特點而受到人們的關(guān)注與研究。1935年蘇聯(lián)科學家孟吉娜從土壤里分離到了一株可以解磷的巨大芽孢桿菌并開始投入生產(chǎn)與繼續(xù)的深入研究。

農(nóng)作物對化肥的利用有限，大量沒有被利用的磷源在土壤中與土壤的某些成分發(fā)生反應(yīng)，變成了植物難以利用的形態(tài)，我們通常稱這種磷為無效態(tài)磷。為了保持農(nóng)作物的產(chǎn)量人們依然會運用大量的化學肥料和有機肥來給予土壤充足的養(yǎng)分，日漸積累便使土壤污染狀況加重。人們不得不開始尋找其他解決方法。實驗證明，微生物對土壤中物質(zhì)的循環(huán)有重要的意義，對磷素循環(huán)也是如此[1]。巨大芽孢桿菌就是其中的一種。

巨大芽孢桿菌在水產(chǎn)上可以起到凈化水體的作用主要體現(xiàn)在對水體中的有機物和磷降解、改善水體的富營養(yǎng)化以及水產(chǎn)養(yǎng)殖的應(yīng)用。菌株在24h 內(nèi)氨碳降解率達到95%以上，并且還具有硝酸還愿與亞硝酸的還原能力，其中的海藻膠裂降解酶、蛋白酶、纖維素酶活性會把構(gòu)成海藻大分子的物質(zhì)逐漸降解為小分子和水溶性物質(zhì)，保留了海藻生物活性與一個樣物質(zhì)，作為水產(chǎn)生產(chǎn)過程中的有益菌進行添加可以解決水體中氨碳污染的問題。在水中添加巨大芽孢桿菌不僅可以分解了池塘中殘留的飼料以及排泄物等有機污染物起到凈化水體的作用還避免了利用化學制劑會引起的第二次水體污染的問題，也可以通過人工的調(diào)控來優(yōu)化水體環(huán)境中的微生物組成和數(shù)量，降低成本低，提高養(yǎng)殖產(chǎn)量，對水產(chǎn)的生產(chǎn)非常具有意義。

在畜牧生產(chǎn)上巨大芽孢桿菌不僅能減少蛋雞腸道和排泄物中的氨氣和硫化氫的排放[2]也能使蛋雞對日糧中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用提高，使蛋雞的采食量減少提高蛋雞的產(chǎn)蛋率，增加蛋雞血清鈣磷含量[3]。有研究表明巨大芽孢桿菌會分泌一種可以降解羽毛角蛋白、酪蛋白的水解酶?？梢葬尫庞鹈薪堑鞍缀屠业鞍资箘游锏鞍踪|(zhì)飼料的生產(chǎn)具有很大的意義，還可以解決畜牧場畜禽排泄物、廢棄墊料的問題遏制污染氣體的源頭，改善我國的畜牧生產(chǎn)環(huán)境，使畜牧養(yǎng)殖成本降低，增加利潤[4]。

2 材料與方法

2.1 實驗設(shè)計 本試驗以巨大芽孢桿菌BM1259為實驗材料，探究巨大芽孢桿菌在不同環(huán)境條件下的生長情況。實驗設(shè)4 種不同條件：不同碳源、不同裝液量、不同接菌量、不同pH 值，每個處理重復(fù)三次，搖床培養(yǎng)48 小時，在12 小時、24 小時、36 小時分別用波長660nm 的分光光度計記錄數(shù)據(jù)，取數(shù)據(jù)的平均值。比較巨大芽孢桿菌在各個條件下的生長情況，找到最佳的生長條件。

2.2 材料

2.2.1 供試桿菌 本試驗所用的BM1259 制劑是由揚州大學動物科學與技術(shù)學院動物營養(yǎng)系提供，含活孢子數(shù)100 億個/g。

2.2.2 培養(yǎng)基配制 稱取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基22g，成分（g/L）：蛋白胨10.0 g，牛肉膏3.0g，NaCl 5.0g，葡萄糖4.0g 蒸餾水1000mL，PH 值7.2-7.4，分裝于150mL 的三角瓶中，每瓶100mL,121℃條件下滅菌15min。用于巨大芽孢桿菌1259 生長特性原始數(shù)據(jù)的檢測。

2.2.3 培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì) 蒸餾水、碳源。不同的碳源有葡萄糖、蔗糖。主要的碳源是葡萄糖。

2.2.4 碳源培養(yǎng)基 碳源5.0g,NaCl 0.1g,磷酸氫二鉀0.05g 七水硫酸美0.025g 水1000ml 蛋白胨0.5g 蒸餾水1000mL,pH 值7.0,分裝于250mL 三角瓶中,每瓶100mL,121C 條件下滅菌15min。蔗糖和葡萄糖用于不同碳源對巨大芽孢桿菌BM1259 生長特性數(shù)據(jù)的測定。萄糖做為唯一的碳源對不同條件下巨大芽孢桿菌BM1259 生長特性數(shù)據(jù)的檢測。

2.2.5 儀器設(shè)備 壓力蒸汽滅菌器、超凈工作臺、搖床器、分光光度儀、實驗室pH 計、電子分析天平、蒸餾裝置、0.5-10ul 的移液槍、20-200ul 的移液槍、酒精燈、10ul 的槍頭、100ul 的槍頭、分離試管，150mL 三角瓶、250mL三角瓶、100mL燒杯、量筒。

2.3 實驗方法

選取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，培養(yǎng)液封口，分裝與100mL 的三角瓶中三組重復(fù)，做好標記分別1、2、3。高壓滅菌后在超凈臺下分裝培養(yǎng)液，接種巨大芽孢桿菌，搖床培養(yǎng)48 小時后，使用比色皿在波長660nm下測定吸光度，記錄數(shù)據(jù)，作為數(shù)據(jù)對照。

選取碳源培養(yǎng)基，培養(yǎng)液封口，分裝與100mL 的三角瓶中三組重復(fù)，做好標記分別4、5、6。高壓滅菌后，調(diào)節(jié)培養(yǎng)液不同pH 值，不同裝液量，不同接菌量后在超凈臺下接種巨大芽孢桿菌BM1259，進行搖床48 小時后，使用比色皿在波長660 nm 下測定吸光度，記錄數(shù)據(jù)。

3 結(jié)果與討論

3.1 巨大芽孢桿菌BM1259 的生長曲線

巨大芽孢桿菌BM1259 的生長特性隨時間變化如圖1所示，10h 內(nèi)巨大芽孢桿菌BM1259 生長遲緩；10-30h 時間段內(nèi)細菌處于對數(shù)生長期，活菌數(shù)呈現(xiàn)對數(shù)直線上升，生長快速；30-50h 內(nèi)細菌處于穩(wěn)定期，此期間細菌數(shù)量處于動態(tài)平衡；50h 之后進入衰亡期，死菌數(shù)超過活菌數(shù)，活菌數(shù)量呈下降趨勢。

圖1 巨大芽孢桿菌BM1259 的生長曲線圖

3.2 添加葡萄糖和蔗糖對巨大芽孢桿菌BM1259生長特性的影響

由圖2可知巨大芽孢桿菌在葡萄糖培養(yǎng)基中的生長特性隨時間變化其中0～10 小時內(nèi)巨大芽孢桿菌生長緩慢屬于適應(yīng)期；10～30 小時內(nèi)活菌呈現(xiàn)對數(shù)直線上升處于對數(shù)期；30 小時后活菌的數(shù)開始呈下降趨勢。

圖2 葡萄糖對巨大芽孢桿菌BM1259 生長曲線的影響

由圖3可知巨大芽孢桿菌在蔗糖培養(yǎng)基中的生長特性隨時間變化其中0～10 小時內(nèi)巨大芽孢桿菌生長緩慢屬于適應(yīng)期；10～30 小時內(nèi)活菌呈現(xiàn)對數(shù)直線上升處于對數(shù)期；30 小時后活菌的數(shù)開始呈下降趨勢。

圖3 蔗糖對巨大芽孢桿菌BM1259 生長曲線的影響

3.2.1 裝液量對巨大芽孢桿菌BM1259 的影響 巨大芽孢桿菌BM1259 按裝液3ml、5ml、7ml 的不同體現(xiàn)出不同的生長特性分別如圖4、圖5、圖6所示，0-12h 內(nèi)巨大芽孢桿菌BM1259 生長遲緩；12-30h 內(nèi)細菌處于對數(shù)生長期，活菌數(shù)呈現(xiàn)對數(shù)直線上升，生長快速，30h 達到細菌生長的最高峰；30-40h 內(nèi)細菌呈現(xiàn)下降趨勢，此期間活細菌有所下降；40-48h 之后進入穩(wěn)定期，細菌處于動態(tài)平衡的狀態(tài)。以接菌量、pH 值為定量，裝液量為變量，可以看出裝液量對巨大芽孢桿菌生長特性的影響大。

圖4 裝液量3ml 對巨大芽孢桿菌BM1259 生長曲線的影響

圖5 裝液量5ml 對巨大芽孢桿菌BM1259 生長曲線的影響

圖6 裝液量7ml 對巨大芽孢桿菌BM1259 生長曲線的影響

3.2.2 接菌量對巨大芽孢桿菌BM1259 的影響巨大芽孢桿菌BM1259按接菌量液3ul、5ul、7ul 的不同體現(xiàn)出不同的生長特性如圖7、圖8、圖9所示，0-12h 內(nèi)巨大芽孢桿菌BM1259 生長遲緩；12-30h 內(nèi)細菌處于對數(shù)生長期，活菌數(shù)呈現(xiàn)對數(shù)直線上升，生長快速，30h 達到細菌生長的最高峰；30-48h 此期間活細菌有所下降；48h 之后會進入穩(wěn)定期，細菌將會處于動態(tài)平衡的狀態(tài)。以裝液量、pH 值為定量，接菌量為變量，可以看出接菌量對巨大芽孢桿菌生長特性的影響大致相同。

圖7 接菌量3ul 對巨大芽孢桿菌BM1259 生長曲線的影響

圖8 接菌量5ul 對巨大芽孢桿菌BM1259 生長曲線的影響

圖9 接菌量7ul 對巨大芽孢桿菌BM1259 生長曲線的影響

3.2.3 pH 對巨大芽孢桿菌BM1259 的影響 巨大芽孢桿菌BM1259 按酸堿度的不同體現(xiàn)出不同的生長特性，當pH 值是5 時，如圖10所示，0-8h內(nèi)巨大芽孢桿菌BM1259 生長遲緩，菌體增大，代謝活躍；8-12 h 時間段內(nèi)細菌處于對數(shù)生長期，活菌數(shù)呈現(xiàn)對數(shù)直線上升，生長期時間比較長，生長快速；12-30h 內(nèi)細菌處于穩(wěn)定期，此期間細菌數(shù)量處于動態(tài)平衡。根據(jù)其酸堿度對巨大芽孢桿菌的影響比較明顯。所以選取其作為研究對象進行討論。

圖10 pH5 對巨大芽孢桿菌BM1259 生長曲線的影響

當pH 值是7 時，如圖11所示，0-2h 內(nèi)巨大芽孢桿菌BM1259 生長遲緩;2-5h 時間段內(nèi)細菌呈現(xiàn)線性生長，細菌代謝非?；钴S，生長飛快；5h后細菌開始衰退，細菌數(shù)降低。

圖11 pH7 對巨大芽孢桿菌BM1259 生長曲線的影響

當pH 值是9 時，如圖12所示，0-2h 內(nèi)巨大芽孢桿菌BM1259 生長遲緩;2-6h 時間段內(nèi)細菌呈現(xiàn)線性生長，細菌代謝非?；钴S，生長飛快；6h后細菌開始衰退，細菌數(shù)降低。

圖12 pH9 對巨大芽孢桿菌BM1259 生長曲線的影響

4 結(jié)論

本次研究主要針對不同條件對巨大芽孢桿菌生長特性的影響，從圖表中可以看出不同的條件對巨大芽孢桿菌的生長曲線有著不同的表現(xiàn)。根據(jù)實驗結(jié)果：

1.葡萄糖和蔗糖對巨大芽孢桿菌的生長曲線沒有明顯影響。

2.相同裝液量中接菌3ul 的巨大芽孢桿菌生長曲線最快達到峰值。

3.不同pH 值中pH=7 時巨大芽孢桿菌的生長曲線最快達到峰值。

由此可知，碳源相同、裝液量相同，培養(yǎng)基的pH 值=7 的條件下接菌量少的巨大芽孢桿菌的生長狀況最好，可以作為發(fā)酵生產(chǎn)參考的依據(jù)。