趙寧?侯成成?章鵬?于仲濤?楊東星?盧偉偉?沈愛(ài)娟?劉鐵?田俊閣?于笑霞

【摘要】目的 研究核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域1（NOD1）和NOD2在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）患者外周血中的表達(dá)水平，初步探討NOD1和NOD2在RA疾病中的作用。方法 采集40例RA患者（RA組）、40例骨關(guān)節(jié)炎（OA）患者（OA組）及40名健康志愿者（對(duì)照組）的外周血標(biāo)本，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），使用熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)3組PBMC中NOD1和NOD2 mRNA水平。隨機(jī)抽取10例RA患者、10例OA患者及10名健康志愿者的PBMC加入胎牛血清培養(yǎng)，并加入胞壁酰二肽（MDP）培養(yǎng)24 h，ELISA法檢測(cè)3組上清液中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平。結(jié)果 3組PBMC中NOD2 mRNA的表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.001），其中RA組PBMC中NOD2 mRNA表達(dá)水平高于其他2組（P均< 0.001），而3組PBMC中NOD1 mRNA表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。MDP作用于3組PBMC后，RA組的IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平均高于另外2組（P均< 0.05），而OA組與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05）。結(jié)論 RA患者的NOD2 mRNA表達(dá)水平較高。NOD2激活可能誘發(fā)IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等促炎因子釋放。NOD2可能參與了RA的發(fā)病過(guò)程。

【關(guān)鍵詞】類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域;外周血單核細(xì)胞;促炎因子

Expression of NOD-like receptors in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis Zhao Ning， Hou Chengcheng， Zhang Peng， Yu Zhongtao， Yang Dongxing， Lu Weiwei， Shen Aijuan， Liu Tie， Tian

Junge， Yu Xiaoxia. Department of Rheumatology and Immunology， Hebei Province Cangzhou Hospital of Integ-rated Traditional and Western Medicine， Cangzhou 061000， China

Corresponding author， Hou Chengcheng， E-mail： m15055308511@ 163. com

【Abstract】Objective To investigate the expression levels of nucleotide-binding oligomerization domain 1 （NOD1） and nucleotide-binding oligomerization domain 2 （NOD2） mRNA in the peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis （RA）， aiming to explore the roles of NOD1 and NOD2 in RA disease. Methods The expression levels of NOD1 and NOD2 mRNA in the peripheral blood mononuclear cells （PBMCs） of 40 patients with RA， 40 osteoarthritis （OA） and 40 healthy volunteers were detected by real-time PCR （qPCR）. PBMCs randomly selected from 10 RA， 10 OA patients and 10 healthy volunteers were supplemented with fetal bovine serum and stimulated by muramyl dipeptide （MDP） for 24 h. The levels of IL-1β， IL-6， IL-8 and TNF-α in the supernatant were detected by ELISA.? Results The expression levels of NOD2 mRNA in PBMCs of significantly differed among three groups （all P < 0.001）. The NOD2 mRNA level in the RA group was significantly higher than those in the other two groups （both P < 0.001）. However， there was no significant difference in the expression of NOD1 mRNA among three groups （P > 0.05）. After adding MDP to the PBMCs， the expression levels of IL-1β， IL-6， IL-8 and TNF-α in the supernatant of PBMCs of RA patients were significantly higher than those in the other two groups （all P < 0.05）， whereas there was no significant difference between the OA and the healthy volunteer groups （all P > 0.05）.? Conclusions The expression level of NOD2 mRNA in PBMCs of RA patients is higher than those of OA patients and healthy volunteers. The activation of NOD2 can induce the release of pro-inflammatory factors， such as IL-1β， IL-6， IL-8 and TNF-α， suggesting that NOD2 may be involved in the pathogenesis of RA.

【Key words】Rheumatoid arthritis;Nucleotide-binding oligomerization domain;

Peripheral blood mononuclear cell;Pro-inflammatory cytokine

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種慢性、全身性自身免疫性疾病，以侵蝕性、對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)。雖然RA的確切發(fā)病機(jī)制尚未明確，但既往研究顯示固有免疫的激活在該病的發(fā)病中起著重要作用[1]。固有免疫系統(tǒng)是機(jī)體抵抗病原微生物和內(nèi)在損傷組織入侵的第一道防線，模式識(shí)別受體（PRR）是固有免疫系統(tǒng)中的重要成員，其可以識(shí)別病原相關(guān)分子模式（PAMP）和損害相關(guān)分子模式（DAMP）產(chǎn)生相應(yīng)的對(duì)抗病原微生物及損害分子的固有免疫反應(yīng)。 PRR主要包括Toll樣受體（TLR）和細(xì)胞內(nèi)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域（NOD）蛋白家族中的NOD樣受體（NLRs）。NOD1和NOD2是NLR中最為重要且研究較多的受體[2-3]。既往研究顯示，NOD1和NOD2激活后可導(dǎo)致多條信號(hào)通路的激活（包括NF-κB及MAPK通路），進(jìn)而釋放多種促炎因子，參與自噬過(guò)程;此外其還與TLR有交叉協(xié)同作用[4]。近年有研究探討了NOD1和NOD2在RA患者的滑膜組織及成纖維樣滑膜細(xì)胞（FLS）中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其可激活MAPK信號(hào)通路，并進(jìn)一步促進(jìn)促炎因子的釋放[5]。Vieira（2012年）進(jìn)行的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NOD2可能參與了RA的炎癥機(jī)制，其信號(hào)通路可能引發(fā)了局部關(guān)節(jié)的免疫炎癥反應(yīng)[8]。本研究旨在初步探討NOD1、NOD2在RA患者的外周血單核細(xì)胞（PBMC）中的表達(dá)水平及其可能發(fā)揮的功能，現(xiàn)報(bào)告如下。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

選擇2018年6月至12月在我院住院的40例RA初治患者（RA組）、40例骨關(guān)節(jié)炎（OA）初治患者（OA組）及40名健康志愿者（對(duì)照組）。RA組納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18 ～ 70歲;②符合 1987年或2010年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）的RA診斷分類標(biāo)準(zhǔn);③患者的28處關(guān)節(jié)疾病活動(dòng)度評(píng)估（DAS28）? ≥4.0。OA組納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18 ～ 70歲;②符合2007年版的OA診治指南相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡18 ～ 70歲，無(wú)風(fēng)濕性疾病或相關(guān)家族史。2組的排除標(biāo)準(zhǔn)：①處于妊娠、分娩及哺乳期的女性患者;②合并嚴(yán)重感染者;③合并惡性腫瘤者;④合并其他自身免疫性疾病;⑤入組前曾使用改善病情抗風(fēng)濕藥（DMARD）、生物制劑及糖皮質(zhì)激素治療。所有入選者均已簽署知情同意書(shū)，研究方案的設(shè)計(jì)及實(shí)施均符合相關(guān)倫理要求。

二、方 法

1. PBMC的分離及培養(yǎng)

采集入選對(duì)象晨起空腹外周血8 ml置于肝素鈉抗凝管，輕輕混勻，將混合后的血樣取4 ml貼著管壁緩慢轉(zhuǎn)移至已加入4 ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管內(nèi)，注意保持液面平整;調(diào)整離心機(jī)溫度24℃，以4000轉(zhuǎn)/分離心10 min。吸取離心管中間層云霧狀液體轉(zhuǎn)移至已事先加入4 ml生理鹽水的離心管內(nèi)，調(diào)整離心機(jī)溫度24℃，以4000轉(zhuǎn)/分離心5 min;棄上清液，加生理鹽水4 ml再次相同條件下離心5 min。離心后棄上清液，離心管底部沉淀物即為PBMC。隨機(jī)抽取10例RA患者、10例OA患者及10名健康志愿者的PBMC置于胎牛血清培養(yǎng)，并加入胞壁酰二肽（MDP）激活NOD2。

2. NOD1和NOD2 mRNA水平檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）法提取3組PBMC的總RNA，加入Trizol試劑 （Life Sciences， 美國(guó)）提取RNA。使用DNA/RNA濃度測(cè)定儀測(cè)定提取的RNA含量，當(dāng)測(cè)量標(biāo)本的260 nm

和280 nm光密度比值位于1.8左右時(shí)，方可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)測(cè)量結(jié)果將RNA濃度稀釋調(diào)整至約200 μg/μl，再次測(cè)量得到準(zhǔn)確濃度后通過(guò)20 μl的反應(yīng)體系（SYBR Green qPCR法）進(jìn)行RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA片段。應(yīng)用7500 Fast Real Time PCR System，采用20 μl的擴(kuò)增體系進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)，引物序列如下：GAPDH 正向5-ATCACCATCTTCCAGGAG-3、反向5-ATGGACTGTGGTCATGAG-3， NOD1正向

5-CAGCACTTTCCCATGTATTGAT-3、反向5-T-

CAAATCCCACACTGCACA-3，NOD2正向5-GG-

TTGATGCCTGTGAACTGAA-3、反向5-AAA-TGAAATGGAACTGCCTCTT-3。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s，然后95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s循環(huán)40次，最后95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95℃ 15 s。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，GAPDH作為對(duì)照基因，計(jì)算目的基因NOD1、NOD2的2-△△Ct值，比較3組間差異。

3. 上清液細(xì)胞因子水平的檢測(cè)

在RPMI培養(yǎng)液中培養(yǎng)RA患者、OA患者及健康志愿者的PBMC（濃度約1×106/L），各加入MDP（InvivoGen，美國(guó)）、MDP Control（InvivoGen，美國(guó)）培養(yǎng)24 h。取其上清液，通過(guò)ELISA法檢測(cè)IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的水平，上述檢測(cè)試劑盒均為美國(guó)R&D公司產(chǎn)品。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t法。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、RA組患者的基本情況及其與OA組及對(duì)照組的性別構(gòu)成、年齡比較

RA組男12例、女28例，年齡（45.4±8.7）歲，OA組男9例、女31例，年齡（47.8±5.7）歲，對(duì)照組男10例、女30例，年齡（46.6±6.8）歲，3組的性別構(gòu)成、年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05）。RA患者的病程為（3.2±1.4）年，DAS28為（5.2±0.8）分，RF（78.5±24.8）kU/L，抗環(huán)瓜氨酸抗體（CCP）陽(yáng)性36例（90%），ESR（85.4±18.2）mm/h，CRP（73.5±25.4）mg/L。

二、RA組、OA組與對(duì)照組PBMC的NOD1、NOD2 mRNA表達(dá)水平比較

3組NOD1 mRNA表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 0.148，P = 0.863）。3組的NOD2 mRNA表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 245.3，P < 0.001），多重比較顯示RA組的NOD2 mRNA表達(dá)水平高于其他2組（P均< 0.001），見(jiàn)圖1。

三、NOD2激活后3組PBMC中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平比較

NOD2的激活劑MDP刺激3組PBMC 24 h后，3組間的IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別為527.0、139.5、156.4、130.7，P均< 0.001），其中RA組PBMC中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平均高于其他2組（P均< 0.05），而OA組與對(duì)照組PBMC中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05），見(jiàn)圖2。

討論

雖然有關(guān)RA確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但是既往研究表明固有免疫細(xì)胞中的PRR在其發(fā)病中起著重要作用，如單核細(xì)胞在RA的滑膜增生及促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生中發(fā)揮著重要的作用。本研究初步探討了未受DMARD作用影響的RA患者與OA患者及健康志愿者的外周血PBMC中與固有免疫相關(guān)的NLR家族成員NOD1及NOD2 mRNA表達(dá)水平差異。研究顯示，RA組PBMC中NOD2 mRNA表達(dá)水平高于其他2組，而NOD1 mRNA表達(dá)水平在3組PBMC中比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。既往國(guó)外也有相似結(jié)論的研究，但是該項(xiàng)研究是在已正規(guī)治療的RA患者中進(jìn)行的，并未排除服用甲氨蝶呤等DMARD的因素[5]。本研究首次探討了初治RA患者中NLR的表達(dá)，排除了藥物治療的影響因素。此外，有部分研究探討了NOD2在RA滑膜組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在RA的滑膜細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)[5-6]。上述研究均是在組織的固有細(xì)胞進(jìn)行的，而本研究是在PBMC中進(jìn)行。通過(guò)體外培養(yǎng)3組PBMC，使用MDP激活NOD2后，研究顯示RA患者的PBMC釋放了大量的炎性細(xì)胞因子，其中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平均比其他2組升高，OA組與對(duì)照組釋放的細(xì)胞因子水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該結(jié)果提示NOD2在RA的關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮著某些致炎作用。近年Kim等[6]研究也顯示NOD2基因和蛋白表達(dá)水平在RA患者中表達(dá)較OA患者明顯增加，而RA患者成纖維樣滑膜細(xì)胞中NOD2基因的下調(diào)可減少促炎因子的生成，此外其下調(diào)還能降低NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。因此，本研究針對(duì)RA患者PBMC中NOD2的研究發(fā)現(xiàn)與既往有關(guān)NOD2在RA局部滑膜細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)相似，均提示NOD2可能在RA發(fā)病機(jī)制的固有免疫中充當(dāng)著重要角色。但是，目前有關(guān)RA發(fā)病中激活NOD2的成分尚不明確，此外其在關(guān)節(jié)及外周血中具體激活通路及致病機(jī)制研究尚少，仍需日后研究進(jìn)行深入探討。

綜上所述，NLRs中NOD2在RA的PBMC中表達(dá)較OA及健康志愿者升高，其激活可誘發(fā)IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等促炎因子釋放，這提示NOD2可能參與RA的發(fā)病過(guò)程，但其具體分子機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

參? 考? 文? 獻(xiàn)

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（收稿日期：2019-06-04）

（本文編輯：林燕薇）