田 麗，時邵輝，胡虹宇，陳勝男，李松美，王春生

（東北林業(yè)大學生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

Oct4是POU(Pit-Oct-Unc)結構域的轉錄因子家族中的一員，由Pou5f1基因編碼[1,2]。它一般通過與保守序列的八個堿基“ATGCAAAT”結合，參與調控下游的基因。Oct4作為多能性基因是最早被發(fā)現的，主要在受精卵、桑椹胚(morula)、卵裂球、囊胚內細胞團以及著床后胚胎的上胚層(epiblast)和原始生殖細胞(primordial germ cells,PGCs)等多能性細胞中表達[3]。例如在小鼠中，將Oct4基因敲除，該胚囊正常植入后不能形成多能性的內細胞團，因此不能正常著床而停滯發(fā)育，在著床前期囊胚階段（胚胎發(fā)育3.5～4.5 d）死亡。表明Oct4基因在早期胚胎發(fā)育過程中形成多能性細胞是必要的[4]。同時研究表明，在體外培養(yǎng)的ES細胞中Oct4基因受到精確調控，只有當Oct4在一定范圍內表達，細胞可保持未分化狀態(tài)。當Oct4表達量比兩倍正常水平還要高時，可導致ES細胞向原始內胚層(primitive endoderm)和中胚層分化；當表達量低于正常水平50%時，ES細胞將會向滋養(yǎng)層（trophectoderm）和原始內胚層分化[5]。但在去除外源性抑制因子的情況下，即使有Oct4基因，ES細胞也會呈現出分化狀態(tài)，這說明Oct4不是維持ES細胞亞全能分化特性的唯一條件，同時也證明了Oct4在ES細胞中的表達確實經過精確調控，其表達水平決定了ES細胞的命運[6]。Oct4基因不僅在ES細胞培養(yǎng)中發(fā)揮重要作用，還是用于產生iPS細胞的大多數轉錄因子混合物中必需的中心重編程因子[7]。

目前，已經克隆了人[8]、豬[9-11]、牛[12]和小鼠[13]等物種的Oct4基因，與其他動物相比，關于綿羊Oct4基因的相關報道很少。在本研究中，從體外發(fā)育的囊胚中擴增出綿羊Oct4基因編碼區(qū)序列，在此基礎上，預測了綿羊Oct4所表達的蛋白質結構，并與其他物種進行了比較，為進一步研究綿羊Oct4基因的功能及利用綿羊源因子誘導綿羊體細胞重編程研究提供依據。

1 材料和方法

1.1 主要試劑、載體和菌株

rTaq DNA聚合酶、T4連接酶、Oligo15引物、iPrep Trizol Plus RNA試劑盒（Invitrogen)、反轉錄試劑盒（TAKARA）、質粒小提小量試劑盒（BioTeke）、膠回收試劑盒（Omega）；pMD18-T 載體；Trans5α 感受態(tài)細胞（TransGen Biotech）。

1.2 綿羊囊胚總RNA的提取

按iPrep Trizol Plus RNA試劑盒的說明書提綿羊囊胚總RNA，置于-80℃冰箱保存。

1.3 總cDNA的獲得

將上述總 RNA 1μg、Oligo15（50uM）1 μL加入 0.2 mL微量離心管中，用 RNase-free H2O 補齊至10 μL，70 ℃水浴 10 min，2 min 冰浴，然后依次添加 5×M-MLV Buffer 2 μL、dNTP（10mM）0.5 μL、RNase Inhibitor 0.25 μL、RTase M-MLV 5 μL 和 RNase-free H2O 0.75 μL，42 ℃水浴 1 h，70 ℃保溫 15 min，冰浴幾分鐘，獲得總cDNA，-20℃條件下保存，用于擴增綿羊Oct4基因。

1.4 引物設計

根據GenBank中牛Oct4基因的CDS部分，與綿羊基因組作對比，得到5個同源序列片段，連接片段，和牛Oct4基因的CDS同源性為97.78%，對應氨基酸序列同源性為98.33%，推測該序列為綿羊Oct4基因的CDS區(qū)，設計該基因上下游引物，并分別引入適當的酶切位點。引物由大連TaKaRa公司合成，引物 相 關 信 息 如 下 ：Oct4-1 5’： GGGAATTATGGCGGGACACCTCGCTTC3’； Oct4-2 5’：GGGCTCGTCAGTTTGAATGCATAGGA 3’。

1.5 Oct4基因的擴增

基于上述實驗所得到的cDNA模板，Oct4-1和Oct4-2作為引物，PCR擴增Oct4基因。PCR反應體系（總 25 μL）：cDNA 1μL，dNTP（2.5 mM）4μL，rTaq Buffer（10x）2.5 μL，上下游引物各 1 μL，rTaq 酶 0.3 μL。PCR 反應條件：94°C預變性 5min；94°C變性 30 S，58°C退火 45 S，72℃延伸90 s，共 30個循環(huán)，循環(huán)結束后72℃延伸7min。

膠回收PCR產物。室溫條件下，與pMD18-T simple載體連接10 min，用5μL連接產物轉化50 μL Trans5α型感受態(tài)細胞，涂平板，用Amp抗性及藍白斑一起進行篩選，挑取白色克隆菌株于含有Amp的LB培養(yǎng)基中，置于搖床中震蕩培養(yǎng)，擴大克隆菌株，質粒小提小量試劑盒提取質粒。

將重組質粒用限制性內切酶BamHI和HindII雙酶切，通過酶切鑒定連接正確的Oct4-pMD18重組質粒，并送Invitrogen公司測序。

1.6 生物信息學分析

分別使用NCBI blastn程序和DNAMAN軟件比對核苷酸序列和推導的氨基酸序列，并利用NCBI網站上的ORF finder分析軟件對開放閱讀框(ORF)進行識別。使用DNAMAN5.2軟件對高同源蛋白的氨基酸序列進行比對，構建了系統進化樹。使用PlantsP(http：//plantsp.genomics.purdue.edu/html/)和ScanProsite軟件(http：//us.expasy.org/prosite/)對蛋白質功能結構域進行分析。使用Psort軟件(http：//psort.ims.u-tokyo.ac.jp/)定位Oct4蛋白的亞細胞。

2 結 果

2.1 PCR擴增綿羊Oct4基因

Oct4-1和Oct4-2作為擴增引物，RT-PCR擴增獲得的模板cDNA，1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，紫外燈照射下可見凝膠上呈現出約1 100 bp的目的條帶（圖1-3）。

圖1 Oct4基因PCR擴增

圖2 pMD18-T simple-Oct4質粒PCR鑒定結果

圖3 pMD18-T simple-Oct4質粒雙酶切鑒定結果

2.2 綿羊Oct4編碼區(qū)核苷酸序列及氨基酸序列分析

生物軟件分析測序正確的Oct4-pMD18重組質粒，分析表明綿羊Oct4基因編碼區(qū)序列長度為1 083 bp包括終止密碼子在內，可以編碼360個氨基酸。綿羊Oct4基因CDS區(qū)的核苷酸序列相比與牛、貓、人、恒河猴、小鼠、兔、大鼠和豬等物種，相應序列的同源性分別為97.8%、91.1%、89.1%、89.0%、82.3%、85.7%、83.2和94.7（圖 4），其氨基酸序列同源性分別為 98.3%、93.1%、91.4%、91.1%、83.8%、85.7%和 97.2（圖 5）。

圖4 綿羊Oct4基因CDS序列與其他物種同源性分析

圖5 綿羊Oct4蛋白氨基酸序列與其他物種同源性分析

利用DNAMAN軟件獲得了九種動物Oct4基因氨基酸序列的系統進化樹。結果表明，與綿羊親緣關系最接近的是牛，具有很小的遺傳距離；與豬、貓、兔、人、恒河猴、小鼠及大鼠親緣關系依次變遠，基本上與傳統分類學保持一致（圖6）。

圖6 九個物種Oct4基因編碼區(qū)核苷酸序列構建的系統進化樹

2.3 分析綿羊Oct4蛋白三維結構

利用在線軟件（http：//prosite.expasy.org/）對綿羊Oct4基因進行分析，分析表明在156-168位氨基酸（KRItLGYtQaDVG）和180-193位氨基酸（SQTTICRFEaLqLS）含有兩個 POU結構域特異性結構（如圖7），在263-286位氨基酸含有1個HOMEOBOX-1結構域（IAqqLgLEkdVVRVWFcNrrqkgK）。

圖7 綿羊Oct4蛋白質的三維結構

3 結論與討論

Oct-4是動物種系之間具有高度保守性的POU轉錄因子，也是迄今發(fā)現最早也是最重要的維持胚胎干細胞多潛能性和促進自我更新的關鍵因子[14,15]。它的表達水平不僅決定了ES細胞的命運，影響其分化狀態(tài)，還在誘導小鼠成纖維細胞成為多功能干細胞過程中發(fā)揮重要作用[16-18]。豬和牛等家畜的Oct4基因已經被克隆，分子特性也已被闡明[9-12,19]。但迄今為止，尚未見到有關綿羊Oct4基因的相關報道。由于Oct4基因具有強組織表達特異性，僅表達與胚胎干細胞和原始生殖細胞等具有多潛能性的細胞中，隨細胞的分化表達量下降，體細胞中未見表達，所以Oct4基因的克隆十分困難。Bao L等[20]也曾嘗試利用小鼠的這四個因子誘導綿羊體細胞重編程，結果表明誘導效率較低，被誘導的細胞不能啟動內源多能性基因的表達。研究組推測各因子氨基酸同源性的不同導致蛋白質空間結構更大的差異是造成異源因子誘導效率低的重要原因之一。因此，為克隆獲得綿羊的Oct4基因序列，本研究利用牛Oct4基因的CDS序列與GenBank的綿羊基因組比對，發(fā)現5個同源結構域，推測為綿羊Oct4基因的5個外顯子，并將該5個外顯子拼接，序列包含1083個堿基，為3的整數倍，且包含終止密碼子“TGA”。針對該序列設計引物，從綿羊囊胚的cDNA中擴增獲得一段基因序列（見圖1-3），該序列與牛CDS的同源性高達97.8%，與其他物種Oct4基因具有82.3%以上的同源性，具有較高的同源性（見圖4）。與此同時，推測的氨基酸序列與牛的同源性高達98.3%（見圖5）。對本研究中獲得的Oct4基因的編碼序列分析顯示，Oct4定位于細胞核中（圖7）并含有符合Pou box氨基酸的統一序列。這些結果說明，Oct4調控綿羊細胞分化過程的機制可能與其他動物相同。

綜上所述，本研究通過整理和合成成功獲得了綿羊的Oct4基因，但該基因是否可用于提高綿羊iPS的誘導效率需要進一步研究驗證。