王鶴辰，包永睿,2,3，王 帥,2,3，李天嬌,2,3，劉金瑛,2,3，孟憲生,2,3＊＊

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 大連 116600；2.遼寧省組分中藥工程技術(shù)研究中心 大連 116600；3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實(shí)驗室 大連 116600）

小薊（Cirsium setosum(Willd.)MB.）俗稱“刺兒菜”，《中國藥典》記載，小薊“涼血止血，祛瘀消腫?！庇糜隰?，吐血，尿血，便血，崩漏下血，外傷出血，癰腫瘡毒[1]。關(guān)于小薊的藥用部位的功效，在不同的典籍中有不同的描述。如《本草圖經(jīng)》中記載：“小薊生搗根絞汁服，以止吐血，衄血、下血?！薄妒?jì)總錄》中記載小薊治療妊娠墮胎后出血不止：“小薊根葉（銼碎）、益母草（去根，切碎）各五兩。以水三大碗，煮二味爛熟去滓至一大碗，將藥于銅器中煎至一盞，分作二服，日內(nèi)服盡。[2-3]”等。小薊用藥的現(xiàn)代研究表明，小薊有止血、收縮血管、抗菌、抗炎、抗癌等作用[4,5]。然而在目前的中藥開發(fā)理論指導(dǎo)下的小薊藥效研究，大都集中在一種或幾種活性物質(zhì)的量的變化與藥效的關(guān)系上[6-9]，對不同的用藥部位的研究卻鮮見報道。本實(shí)驗旨在研究小薊根莖葉花在成分與抗炎，止血藥效方面的區(qū)別。

本實(shí)驗采用對照品比對鑒定色譜峰的種類，以不同藥用部位的指紋圖譜作為物質(zhì)基礎(chǔ)，比較小薊不同藥用部位提取物的抗炎與促凝血藥效的區(qū)別，使用灰色關(guān)聯(lián)計算軟件計算出檢定出的每種成分對抗炎與凝血酶原指標(biāo)的貢獻(xiàn)程度，嘗試篩選出治療一種病癥的最優(yōu)藥用部位，建立了多種化合物與藥效的聯(lián)系[10]。提出了一個精準(zhǔn)的分析方法，為傳統(tǒng)中藥小薊的合理使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

NUAIRETM US AUTOFLOW型CO2培養(yǎng)箱（德國NUAIRE公司）；Agilent 1290型快速高效液相色譜儀（安捷倫公司）。

1.2 試劑與藥材

KM小鼠（遼寧長生生物有限公司，許可證號：SCXK（遼）2018-0301），乙腈（色譜純，德國Merck公司）；冰乙酸（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；小鼠凝血酶原(PT)酶聯(lián)免疫試劑盒；小薊藥材（購自山東，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室許亮教授鑒定為菊科植物小薊（Cirsium setosum(Willd.)MB.）的干燥全株）。

1.3 供試品溶液的制備

將小薊藥材按根、莖、葉、花分開，粉碎，過3號篩，各取粉末約5.0 g，置于圓底燒瓶中，精密加入200 mL的95%乙醇溶液，加熱回流提取1 h，放冷，濾過，取續(xù)濾液搖勻過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

1.4 小薊不同藥用部位指紋圖譜的建立

1.4.1 色譜條件

色譜柱Agilent poroshell SB-C18（4.6 mm×100 mm,2.7 μm），流動相乙腈（B）-0.5%冰乙酸（A），梯度洗脫，0-6min 5.0%-13%B，6-20 min 13%B，20-60 min 13%-22%B，60-90 min 22.0%-100.0%B，柱溫30℃，檢測波長：260 n，供試品進(jìn)樣量10 μL。

1.4.2 HPLC指紋圖譜的建立

取1.3項供試品溶液按2.2.1項色譜條件，進(jìn)行分析檢測，得到小薊藥材不同入藥部位的液相圖譜。將圖譜信息導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度評價軟件（2012版），得到小薊不同用藥部位的指紋圖譜。

1.5 對照品比對鑒定色譜峰成分

經(jīng)前期文獻(xiàn)調(diào)研，明確了多種在小薊藥材中可能存在的與抗炎、促凝血相關(guān)的活性成分[11,12]。經(jīng)過比對保留時間，最終確定了11種存在于小薊藥材中的成分。

1.6 小薊不同部位提取物在抗炎，止血方面的藥效學(xué)評價

1.6.1 小薊不同部位提取物對小鼠炎癥RAW264.7細(xì)胞的抑制作用

RAW264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板中，取4種供試品溶液各2.5 mL，濾過，揮干后分別溶于10 mL培養(yǎng)液中（經(jīng)計算，濃度為每毫升培養(yǎng)液中含0.062 5 g生藥提取物）。待細(xì)胞貼壁后，將孔內(nèi)空白培養(yǎng)液替換為加藥培養(yǎng)液作用24 h（每組十個復(fù)孔）。使用MTT法染色，使用酶標(biāo)儀檢測活細(xì)胞數(shù)量，計算方法如下。

1.6.2 小薊不同部位提取物對小鼠血漿中凝血酶原指標(biāo)的影響

將60只KM小鼠（雄性，20-22 g）按根，莖，葉，花，西陽，空白平均分成6組，每組10只，西陽藥物選用維生素K3。每次按0.025 g生藥量/只給藥，西陽按每次0.0125 g·只-1給藥，空白組給予相同體積生理鹽水。連續(xù)灌胃7天，以肝素鈉為抗凝劑取血漿，按試劑盒說明書操作，每組取5個復(fù)孔。使用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，將每個復(fù)孔的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，根據(jù)試劑盒的原理，酶標(biāo)儀的示數(shù)越大，產(chǎn)生的指標(biāo)物質(zhì)越多，說明藥效越好。

1.7 灰色關(guān)聯(lián)度分析

分別將小薊四個不同部位提取物對RAW細(xì)胞的抑制率、四個不同部位提取物對小鼠凝血酶原的指標(biāo)數(shù)值作為母序列，圖譜中11種成分的峰面積作為子序列，采用灰色關(guān)聯(lián)度分析軟件(GreyModeling V3.0)進(jìn)行分析。得出小薊不同藥用部位色譜峰與其對RAW細(xì)胞的抑制率與小鼠凝血酶原指標(biāo)的關(guān)聯(lián)系數(shù)（貢獻(xiàn)程度）。

2 結(jié)果

小薊不同用藥部位化合物保留時間與峰面積信息（表1），指紋圖譜信息（圖1）。

體外實(shí)驗結(jié)果顯示，小薊花的藥效最強(qiáng)對RAW264.7細(xì)胞的抑制率最大，根次之，莖與葉對RAW264.7細(xì)胞的抑制率作用不大（圖2）。試劑盒的結(jié)果數(shù)據(jù)顯示，小薊花對小鼠凝血酶原指標(biāo)影響最大，葉次之，莖與根對指標(biāo)影響較小（圖3）。

使用GreyModeling V3.0軟件，計算出小薊不同藥用部位的色譜峰面積與RAW細(xì)胞的抑制率以及小鼠凝血酶原指標(biāo)的關(guān)聯(lián)系數(shù)信息（圖4）。結(jié)果顯示，綠原酸、橙皮苷、咖啡酸、蒙花苷對抑制炎癥細(xì)胞增值（抗炎）與升高凝血酶原指標(biāo)（止血）的關(guān)聯(lián)系數(shù)與其他成分相比較高，說明這四種成分對抗炎與止血的貢獻(xiàn)程度較大。

圖1 小薊不同部位指紋圖譜與共有峰

表1 小薊藥材中不同部位的化學(xué)成分

3 討論

中藥的藥用部位在典籍中有很多記載，其中針對不同的病癥，往往施用不同的藥用部位。這提示現(xiàn)代的研究者，應(yīng)該開展針對不同部位的相關(guān)研究。中藥的現(xiàn)代研究表明，中藥的藥效與中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)緊密相關(guān)，通過對藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究可以對中藥的傳統(tǒng)理論賦予現(xiàn)代的科學(xué)解釋[13]。中藥中成分組成復(fù)雜多樣，只通過測定其中一種或幾種成分的含量通常無法全面地說明中藥質(zhì)量與療效的好壞[14]。所以，研究生藥不同采收時間、不同用藥部位化學(xué)成分差異與不同病癥療效之間的關(guān)系，明確生藥的精準(zhǔn)應(yīng)用意義重大。

圖2 小薊不同部位對RAW264.7細(xì)胞的體外抑制率

圖3 小薊不同部位的小鼠凝血酶原（PT）試劑盒結(jié)果（P＜0.05）

本實(shí)驗以傳統(tǒng)中藥小薊為研究對象，建立了不同藥用部位的指紋圖譜，針對外抗炎藥效與凝血酶原（PT）指標(biāo)，研究了小薊不同部位的精準(zhǔn)使用。結(jié)果顯示，不同的部位成分種類與含量差異較大，從指紋圖譜中峰面積及數(shù)量可以看出，小薊全株中4個部位的化學(xué)成分具有一定的差異性。小薊花中成分種類最多，根中成分種類最少，而莖與葉中成分種類基本一致，含量有所區(qū)別。

圖4 GreyModeling V3.0軟件計算出小薊中11種成分對抗炎，凝血的貢獻(xiàn)程度（P＜0.05）

小薊可清熱消腫，在前期的相關(guān)研究中，我們發(fā)現(xiàn)小薊黃酮中的一些成分可以對癌細(xì)胞有較好的抑制作用[15]，而炎癥與癌癥的產(chǎn)生往往存在先后順序[16]。這也提示我們，研究小薊提取物的抗炎作用有很大的意義。古籍中記載小薊能“涼血止血”，在歷史上小薊也多用于治療血流不止。而止血與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)凝血的概念類似，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為凝血其基本過程是一系列蛋白質(zhì)的有限水解過程，大體上分為三個階段，凝血酶原激活物形成、凝血酶形成、纖維蛋白形成，其中凝血酶原的形成是整個凝血過程的重要一步（在體內(nèi)需要維生素K參與）。

本實(shí)驗選取凝血酶原作為檢測指標(biāo)，以維生素K3作為西陽對照組，小薊不同部位提取物對指標(biāo)的影響也就反映了其對促進(jìn)凝血的效果，數(shù)值越大，產(chǎn)生的促凝血指標(biāo)物質(zhì)的量與陽性藥維生素K3越接近。體外藥效結(jié)果顯示，小薊花的抗炎效果最好，小薊根也有一定的效果。而凝血酶原（PT）試劑盒的結(jié)果表明，小薊花的促凝血效果最好，除西陽組外，產(chǎn)生的指標(biāo)物質(zhì)最多，小薊葉也有一定的效果。試劑盒與體外實(shí)驗結(jié)果說明，小薊不同部位化學(xué)成分種類與含量的差異是導(dǎo)致藥效有區(qū)別的原因?；疑P(guān)聯(lián)度計算軟件的結(jié)果顯示，綠原酸、橙皮苷、咖啡酸、蒙花苷等成分對小薊提取物的體外抗炎效果與影響凝血酶原指標(biāo)的產(chǎn)生貢獻(xiàn)程度與其他成分相比較大并存在差異。植物化學(xué)研究表明，小薊主要含有黃酮類、酚酸類以及甾醇類化合物。其中，黃酮類成分是影響其藥理學(xué)活性的主要因素?，F(xiàn)代藥理學(xué)和臨床研究表明小薊中的一些成分具有止血、抗炎、抗腫瘤、抗微生物等作用。其中綠原酸、咖啡酸可以通過影響NF-κB信號通路，減少炎癥介質(zhì)的釋放。蒙花苷能緩解血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷，橙皮苷通過降低毛細(xì)管脆性，有保護(hù)毛細(xì)血管的作用[17-20]。本實(shí)驗的灰色關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)結(jié)果也佐證了小薊黃酮類物質(zhì)的現(xiàn)代藥理學(xué)研究。

中藥的現(xiàn)代化已經(jīng)實(shí)踐多年，成果顯著。隨著分析與檢測手段的不斷進(jìn)步，對于傳統(tǒng)理論的科學(xué)解釋也越來越豐富[21-23]。研究中藥不同部位的使用，為中藥的現(xiàn)代化打開了一個新的思路。本實(shí)驗為小薊藥材不同藥用部位的合理使用提供了一個科學(xué)的依據(jù)及分析方法，也為提高小薊藥材的治療效果提供了一個理論支持。