鄭淑丹，陳鋼，闕發(fā)秀，萬聆，鄧山鴻，簡素平

(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(南昌大學(xué))，江西 南昌，330047)

果酒是由酵母經(jīng)過一系列復(fù)雜的微生物反應(yīng)發(fā)酵而來的，酵母在整個(gè)過程中起著關(guān)鍵作用。依據(jù)酵母的功能特點(diǎn)，一類是釀酒酵母，其具有較高的酒精發(fā)酵力，發(fā)酵效率也較快[1]；另一類是非釀酒酵母，可以產(chǎn)生多種酶類(蛋白酶、酯酶、糖苷酶、果膠酶等)，其中糖苷酶能水解原料中的非揮發(fā)性糖苷類前體物質(zhì)，使其轉(zhuǎn)換為各種風(fēng)味物質(zhì)，如酯、高級醇、萜烯類等[2-3]。因此，充分利用兩類酵母的特性進(jìn)行混合發(fā)酵實(shí)現(xiàn)“取長補(bǔ)短”，不僅可以增加風(fēng)味物質(zhì)的生成，還可以降低乙酸、乙醛等異味物質(zhì)的含量，從而改善果酒的口感和風(fēng)味[4-5]。有研究表明，在混合同時(shí)發(fā)酵的過程中，非釀酒酵母在發(fā)酵初期發(fā)揮著主要作用，但因其耐酒精力較差、對營養(yǎng)物質(zhì)的競爭力弱等缺陷[6-7]，在發(fā)酵1～3 d后，釀酒酵母將其取代成為優(yōu)勢菌株，限制了非釀酒酵母對果酒風(fēng)味物質(zhì)形成的貢獻(xiàn)[8]。因此，本論文研究了非釀酒酵母和釀酒酵母在混合培養(yǎng)時(shí)的接種順序?qū)湍干L及風(fēng)味物質(zhì)的影響，使兩種酵母的特性得以充分展現(xiàn)，從而為釀造品質(zhì)更佳的臍橙果酒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

臍橙,江西省贛州地區(qū)信豐市；食品級白砂糖,深圳安泰生物科技有限公司；釀酒酵母、檸檬形克勒克酵母(K.apiculata) 1466,中國工業(yè)菌種保藏中心；果膠酶(酶活力>50 000 U/g),上海源聚生物科技有限公司；偏重亞硫酸鉀(食品級),長沙科迪亞實(shí)業(yè)有限公司；3-辛醇(色譜純),美國Sigma公司；β-環(huán)糊精(分析純),廣州一碼生物有限公司；賴氨酸培養(yǎng)基(LYS)、酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂(WL)培養(yǎng)基,青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HR1882型榨汁機(jī)，飛利浦(中國)投資有限公司；MP2002電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；WYT-J型手持糖度計(jì)，成都光學(xué)廠；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；pH S22型數(shù)顯酸度計(jì)，Sartorius公司；酒精計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；VS-1300型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；微量移液器，上海熱電儀器有限公司；5975-6890N GC-MS聯(lián)用儀，美國Agilent公司；二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷萃取頭，美國Supelco公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 臍橙全果酒釀造工藝流程[9]

1.3.2 臍橙全果酒的接種方式

酵母活化：將釀酒酵母和檸檬形克勒克酵母分別劃線于YPD固體培養(yǎng)基上，在恒溫箱中(30 ℃)培養(yǎng)48 h。隨后分別取一環(huán)平板活化的酵母于50 mL YPD液體培養(yǎng)基中，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中(30 ℃，150 r/min) 培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)好的酵母放在冰箱中(4 ℃) 保藏備用。

接種方式：同時(shí)接種，將釀酒酵母和檸檬形克勒克酵母同時(shí)接入200 mL的臍橙全果酒發(fā)酵液中，接種量均為6 lg CFU/mL。

順序接種：先接種檸檬形克勒克酵母(6 lg CFU/mL)，72 h后再接種釀酒酵母(6 lg CFU/mL)。

以釀酒酵母和檸檬形克勒克酵母的單獨(dú)發(fā)酵作為對照，接種量均為6 lg CFU/mL。

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 常規(guī)理化成分分析[10]

酒精度,酒精計(jì)法；糖度,手持折光儀法；殘?zhí)呛?斐林試劑滴定法；SO2測定,直接碘量法；pH值,采用pH S22型酸度計(jì)定。理化指標(biāo)重復(fù)測定3次。

1.4.2 酵母計(jì)數(shù)

由于釀酒酵母在賴氨酸瓊脂培養(yǎng)基(LYS)上不能生長，所以用賴氨酸培養(yǎng)基對非釀酒酵母進(jìn)行計(jì)數(shù)，用WL培養(yǎng)基對釀酒酵母進(jìn)行計(jì)數(shù)，均采用平板計(jì)數(shù)法。

1.4.3 GC-MS分析[11-12]

將固相微萃取萃取頭在GC-MS儀的進(jìn)樣口老化，老化溫度250 ℃，老化時(shí)間30 min，載氣流速1.0 mL/min。

取10 mL臍橙酒樣于25 mL螺口進(jìn)樣瓶中，加入內(nèi)標(biāo)物3-辛醇(400 μg/L) 5 μL和0.1 g/mL NaCl溶液，密封置于45 ℃水浴中平衡30 min。平衡后插入經(jīng)過老化處理的固相微萃取頭，頂空萃取40 min后，再將萃取頭插入GC進(jìn)樣口，解吸5 min。

1.4.3.1 色譜條件

色譜柱DB-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 mm)；升溫程序：40 ℃保持3 min，以3 ℃/min的速率升到160 ℃，保持2 min，然后以8 ℃/min的速率升至230 ℃， 保持3 min；He流量1.0 mL/min；無分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度：250 ℃。

1.4.3.2 質(zhì)譜條件

電子電離源；離子源溫度230 ℃；接口溫度250 ℃；電子能量70 eV；燈絲發(fā)熱電流0.25 mA；掃描速率全程33～450m/z。

1.4.3.3 香氣成分分析

定性定量分析：運(yùn)用計(jì)算機(jī)譜庫(NIST/WILEY)進(jìn)行初步檢索及資料分析，并結(jié)合已有的相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行定性分析?？筛鶕?jù)內(nèi)標(biāo)物3-辛醇(400 μg/L)進(jìn)行定量分析，采用峰面積法計(jì)算出其含量。氣味活度值(odour activity value, OAV)分析如公式(1)。

(1)

式中：ρ，香氣物質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/L；T，感官閾值，mg/L。

主成分分析：采用SPSS 17.0軟件，對不同香氣成分進(jìn)行主成分分析。

1.4.4 感官評定

參照GB/T 10220—2012 《感官分析方法學(xué)總論》要求組建感官評定小組(20人)[13]，參考GB/T 15038—2006 制定評分標(biāo)準(zhǔn)，并依據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)對臍橙全果酒進(jìn)行感官評分，取其平均值作為評分結(jié)果。感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 臍橙酒感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of navel orange wine

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中酵母數(shù)量的變化

酵母對果酒最終風(fēng)味特性的貢獻(xiàn)在很大程度上取決于發(fā)酵過程中酵母數(shù)量的持久性。發(fā)酵過程中酵母數(shù)量的動態(tài)變化如圖1、圖2所示。在釀酒酵母和檸檬形克勒克酵母的單獨(dú)發(fā)酵過程中，前48 h內(nèi)2種酵母均處于快速增長階段，但檸檬形克勒克酵母的生長速率要低于釀酒酵母。釀酒酵母在第3天達(dá)到最大值(8.26 lg CFU/mL)，而檸檬形克勒克酵母的最大值(7.41 lg CFU/mL)則在第5天達(dá)到。

圖1 不同培養(yǎng)條件下混合同時(shí)發(fā)酵過程中酵母的變化Fig.1 Yeast quantity in mixed simultaneous fermentation under different inoculating conditions

圖2 不同培養(yǎng)條件下混合順序發(fā)酵過程中酵母的變化Fig.2 Yeast quantity in mixed sequential fermentation under different inoculating conditions

當(dāng)釀酒酵母和檸檬形克勒克酵母混合發(fā)酵時(shí)，由于營養(yǎng)物質(zhì)、空間的競爭，以及酵母之間的相互抑制，兩種酵母的最大細(xì)胞量均比單獨(dú)發(fā)酵時(shí)小[14]。當(dāng)兩種酵母同時(shí)接種時(shí)，釀酒酵母優(yōu)先利用營養(yǎng)物質(zhì)而迅速增值，而檸檬形克勒克酵母則由于較弱的競爭力以及釀酒酵母代謝物的抑制，生長較為緩慢[15]。當(dāng)2種酵母順序接種時(shí)，使檸檬形克勒克酵母生長到一定數(shù)量后，再接種釀酒酵母，從而減弱檸檬形克勒克酵母的劣勢，延長了其生長時(shí)間。

2.2 香氣成分分析

高級醇是由相應(yīng)的氨基酸通過Ehrlich途徑轉(zhuǎn)化，或是糖的分解代謝產(chǎn)生的[16]，是果酒中的主要香氣物質(zhì)。異丁醇、異戊醇、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇在不同方式發(fā)酵的臍橙全果酒中含量均較高，均具有水果的甜香和醇香，且能持久保存[17]，是臍橙果酒典型的香氣成分。另外，2-癸醇只在非釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵和順序發(fā)酵時(shí)發(fā)現(xiàn)，而1-壬醇只存在于釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵和同時(shí)發(fā)酵中。釀酒酵母生成高級醇的能力較強(qiáng)[18]，單獨(dú)發(fā)酵時(shí)，釀酒酵母合成的高級醇是檸檬形克勒克酵母的1.5倍。另外，同時(shí)發(fā)酵時(shí)高級醇的含量相比釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵增加了3.17%，可能是由于發(fā)酵后期檸檬形克勒克酵母衰亡，其自身分解為營養(yǎng)物質(zhì)被釀酒酵母所利用[19]。但是，順序發(fā)酵時(shí)某些高級醇的含量卻有所下降，這與檸檬形克勒克酵母將其轉(zhuǎn)化為酯類有關(guān)[20]。

酸類物質(zhì)是酵母代謝的次級產(chǎn)物，也是合成酯的前體物質(zhì)。當(dāng)有非釀酒酵母存在時(shí)，會將大部分乙酰輔酶A用于酯的合成，而合成脂肪酸的乙酰輔酶A不足，從而導(dǎo)致酸類物質(zhì)含量偏低[7]。臍橙全果酒中存在的酸類為乙酸、己酸和辛酸，這些酸少量存在時(shí)可以為臍橙酒帶來一定的乳酪、脂肪香味，但含量過高則會對酒體的香氣和品質(zhì)帶來負(fù)面影響[21]。因此，混合發(fā)酵在減少酸類物質(zhì)產(chǎn)生不良影響方面具有一定作用。

酯類物質(zhì)是果酒中香氣成分的重要貢獻(xiàn)者。臍橙全果酒中乙酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯的含量最高，為增添酒中香氣的復(fù)雜性和典型性有一定的貢獻(xiàn)[22]。非釀酒酵母的產(chǎn)酯能力高于釀酒酵母，在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生更多的酶，從而將醇和酸通過酯酶合成途徑轉(zhuǎn)化為酯[23]。因此，混合發(fā)酵酒中大多數(shù)酯類物質(zhì)的含量均高于單獨(dú)發(fā)酵酒，且混合順序發(fā)酵時(shí)含量更多。表明先接種檸檬形克勒克酵母，延長了其存活時(shí)間，有利于合成更多的酯類物質(zhì)[24]。

萜烯類物質(zhì)在賦予果酒花果的芳香方面起著重要作用。臍橙全果酒中萜烯類化合物含量均占香氣成分的30%以上。順序發(fā)酵酒中的萜烯類物質(zhì)的種類和含量均最多，且里哪醇、D-檸檬烯的含量要明顯高于同時(shí)發(fā)酵，反式相芹醇也只存在于混合順序發(fā)酵酒中，這些萜烯類化合物可以給予臍橙全果酒更獨(dú)特更濃郁的橙香和甜香[25](表2)。

2.3 氣味活度值(OAV)分析

香氣成分濃度和貢獻(xiàn)率并不一定成正比，還與其閾值有關(guān)。OAV反映了香氣成分揮發(fā)性的大小及難易程度，能較客觀地體現(xiàn)香氣成分對酒風(fēng)味的影響[26]。當(dāng)OAV值>1時(shí)，其對香氣的呈現(xiàn)有較大的貢獻(xiàn)。

由表3分析可知，醇類物質(zhì)的OAV值均<1，但在協(xié)調(diào)臍橙酒的口感和風(fēng)味方面起著不可忽視的作用。酸類物質(zhì)中，乙酸的OAV值>1，但過量的乙酸會使果酒產(chǎn)生不愉快的脂肪味和刺鼻的味道[21]，混合順序發(fā)酵酒中乙酸的OAV值最低，有利于減少其帶來的不良風(fēng)味。酯類物質(zhì)中，辛酸乙酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯、丁酸乙酯的OAV值均>1。其中，乙酸異戊酯和己酸乙酯的OAV值較大，且混合發(fā)酵酒中其值明顯高于單獨(dú)發(fā)酵酒，賦予臍橙全果酒更濃郁的花果香、茴香和蜜糖味。除純釀酒酵母發(fā)酵酒中的橙花叔醇外，萜烯類化合物的OAV值均>1，對整體酒質(zhì)結(jié)構(gòu)起著重要作用。D-檸檬烯和里哪醇被視為臍橙全果酒的特征香氣成分，嗅覺閾值低，OAV值高，賦予其愉悅的甜香、花果香，以及獨(dú)特的臍橙風(fēng)味[25]。酯類和萜烯類物質(zhì)大多數(shù)情況下，混合順序發(fā)酵酒中含量最高，OAV值最大，香氣特征最突出。

表2 臍橙全果酒風(fēng)味物質(zhì)Table 2 Flavor components of different navel orange wine

注：“-”代表未檢測出。下同。

表3 臍橙全果酒風(fēng)味物質(zhì)的OAV分析Table 3 OAVs of flavor components in different navel orange wine

2.4 主成分分析

為進(jìn)一步探究4種臍橙全果酒的差異所在，對酒中的風(fēng)味物質(zhì)含量進(jìn)行主成分分析。主成分1和主成分2的方差貢獻(xiàn)率分別為57.57%，30.26%，二者累計(jì)貢獻(xiàn)率已達(dá)到87.83%，基本可以體現(xiàn)臍橙全果酒中的風(fēng)味物質(zhì)信息，因此選取前2個(gè)主成分進(jìn)行分析。

因子載荷系數(shù)反映了臍橙全果酒中各風(fēng)味物質(zhì)對各主成分的影響，相關(guān)系數(shù)越大，該物質(zhì)在主成分中的代表性就越強(qiáng)[27]。里哪醇(0.985)、4-萜品醇(0.986)、薄荷酮(0.974)、癸酸乙酯(0.961)、香茅醇(0.941)、丙酸香芹酯(0.949)、乙酸苯乙酯(0.943)、薄荷醇(0.957)、橙花叔醇(0.960)和對乙基苯酚(0.968) 與主成分1高度正相關(guān)；而乙酸(-0.966)、己酸(-0.863)、辛酸(-0.895)和1-壬醇(-0.584)與主成分1呈高度負(fù)相關(guān)；異戊醇(0.916)、異丁醇(0.968)、正辛醇(0.963)、正己醇(0.983)、乙偶姻(0.860)和苯乙醇(0.906) 與主成分2呈高度正相關(guān)；β-松油醇(-0.788)、反式香芹醇(-0.568)、丁酸乙酯(-0.577)和苯甲酸乙酯(-0.611)與主成分2高度負(fù)相關(guān)。

這4種方式發(fā)酵的臍橙全果酒整體風(fēng)味有較大的差異。混合發(fā)酵的臍橙酒均位于第一象限，主要風(fēng)味物質(zhì)比較接近?；旌享樞虬l(fā)酵酒中萜烯類物質(zhì)(里哪醇、4-萜品醇、香茅醇、薄荷醇、橙花叔醇)對其影響更大，而醇類物質(zhì)(正己醇、異丙醇)在混合同時(shí)發(fā)酵酒中更豐富。檸檬形克勒克酵母單獨(dú)發(fā)酵酒位于第四象限，β-松油醇、苯甲酸乙酯、丁酸乙酯、反式香芹醇、月桂酸乙酯、2-癸醇、丙酸香芹酯是其主要風(fēng)味物質(zhì)；而純釀酒酵母發(fā)酵酒則位于第二象限，主要風(fēng)味物質(zhì)為辛酸、乙酸、1-壬醇、苯乙醇、異戊醇(圖3、圖4)。

圖3 不同揮發(fā)性成分的主成分分析Fig.3 Principal component analysis of different volatile components

圖4 不同酒樣的主成分分析Fig.4 Principal component analysis of different wine samples

2.5 不同方式發(fā)酵臍橙全果酒感官評定

由表4可知，4種臍橙全果酒外觀評分上比較接近，但在香氣和典型性方面有顯著的差異，純釀酒酵母發(fā)酵酒得分最低，混合順序發(fā)酵酒則最高。由于檸檬形克勒克酵母單獨(dú)發(fā)酵時(shí)不徹底，所得臍橙全果酒在滋味呈現(xiàn)上較差。綜合分析看來，混合順序發(fā)酵的臍橙全果酒感官評分最高(89.87)，且色澤澄清透明、酒體豐滿、臍橙香氣特征突出、風(fēng)格典型獨(dú)特。

3 結(jié)論

不同接種方式發(fā)酵對臍橙全果酒風(fēng)味物質(zhì)的研究結(jié)果表明，采用先接種檸檬形克勒克酵母72 h后再接種釀酒酵母的混合順序發(fā)酵，減弱了非釀酒酵母的劣勢，在確保發(fā)酵順利完成的情況下使其發(fā)揮更有效的作用。通過GC-MS進(jìn)行香氣成分的鑒定，并結(jié)合氣味活度值(OAV)進(jìn)行分析，4種接種方式發(fā)酵的臍橙全果酒中共檢測到38種香氣成分，包括醇類9種、酯類11種，萜烯類9種、酮和酚類5種，其在定性和定量上均有一定的差異。雖然高級醇在果酒中的含量較高，但因其OAV值均<1，所以香氣特征不明顯?；旌享樞虬l(fā)酵酒中酸類物質(zhì)含量最低，減少了其含量過高產(chǎn)生的不良影響?；旌习l(fā)酵酒中大多數(shù)酯類物質(zhì)含量均高于單獨(dú)發(fā)酵，且混合順序發(fā)酵酒中含量更多。其中，辛酸乙酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯、丁酸乙酯的OAV值均>1，增添了臍橙全果酒中香氣的復(fù)雜性和典型性。萜烯類化合物所占比例最大，OAV值均>1，且混合順序發(fā)酵酒中其種類和含量均最豐富，對臍橙全果酒獨(dú)特風(fēng)味的呈現(xiàn)起著重要作用。通過主成分分析，4種方式發(fā)酵的臍橙全果酒在整體風(fēng)味上有較大差異，混合發(fā)酵酒的主要風(fēng)味物質(zhì)相接近，純釀酒酵母發(fā)酵酒的風(fēng)味最差，其結(jié)果與感官評分一致。綜合分析看來，混合順序發(fā)酵的臍橙全果酒，在檸檬形克勒克酵母和釀酒酵母的協(xié)同作用下，有效地促進(jìn)了更多酯類、萜烯類物質(zhì)的合成，增加了香氣成分的種類，改善了果酒的品質(zhì)和風(fēng)味，風(fēng)格更加典型獨(dú)特。

表4 不同方式發(fā)酵臍橙全果酒感官評定表Table 4 Sensory evaluation of navel orange wine fermented in different ways