關(guān)樺楠，龔德?tīng)?，宋巖，韓博林，梁金鐘，王薇，宇佳

1(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱，150076) 2(東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱，150040)

以金納米粒子為代表的貴金屬納米材料因其具有良好的生物相容性、較大的比表面積和活躍的光電化學(xué)性質(zhì)，已被廣泛應(yīng)用于生物分析檢測(cè)領(lǐng)域[1-4]。金納米粒子具有典型的表面等離子體共振特性，且不同形態(tài)的金納米粒子(顆粒狀、棒狀、線狀和星狀)具有不同的共振特性[5-7]，這使其具有特定的尺寸效應(yīng)，即當(dāng)粒子間隙大于平均粒徑時(shí)，整個(gè)體系呈現(xiàn)出肉眼可見(jiàn)的酒紅色，而當(dāng)粒子間隙小于平均粒徑時(shí)，體系顏色由酒紅色向藍(lán)紫色轉(zhuǎn)變[8-11]。根據(jù)這一特性，可以通過(guò)金納米粒子體系顏色的變化來(lái)判斷粒子間的分散和團(tuán)聚。聚谷氨酸(poly-γ-glutamic acid，PGA)具有良好的生物相容性、生物可降解性和水溶性等特性，是醫(yī)藥、食品、水處理、農(nóng)業(yè)等行業(yè)的研究熱點(diǎn)[12-16]。利用微生物天然發(fā)酵產(chǎn)物聚合制備γ-PGA，原料易得且可循環(huán)再生，符合可持續(xù)發(fā)展的觀點(diǎn)，具有很好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和應(yīng)用前景[17-19]。本實(shí)驗(yàn)選取CTAB還原法制備出星狀金納米粒子，且表面帶有正電荷；選擇表面帶有負(fù)電荷的聚谷氨酸，依靠靜電吸附作用，修飾在金納米星的表面；利用聚谷氨酸在不同pH條件下，因其氨基酸結(jié)構(gòu)發(fā)生變化所造成的金納米星發(fā)生自組裝-去自組裝的變化，進(jìn)而來(lái)考察聚谷氨酸修飾金納米星(poly-γ-glutamic acid-stabilized gold nanoparticles, PGA-AuNPs)在不同的酸堿度條件下的響應(yīng)情況。本實(shí)驗(yàn)將為食品工業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)藥研發(fā)和環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域開(kāi)發(fā)新型pH敏感響應(yīng)材料提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

用于發(fā)酵生產(chǎn)聚谷氨酸的枯草芽孢桿菌，由哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室改良提供；氯金酸、K2CO3、AgNO3和抗壞血酸，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,CTAB)和硼氫化鈉，購(gòu)自上海振興化工一廠；本實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

2000 EX透射電子顯微鏡，日本JEOL公司；UV2250紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)，北京桑翌科技發(fā)展有限公司；F2500型熒光分光光度計(jì)，日本日立公司；MAGNA-IR560E.S.P型傅里葉變換紅外光譜儀，美國(guó)Nicolet公司；BT-9300H激光粒度分布儀，中國(guó)昆山廣測(cè)儀器設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 星狀金納米粒子的制備與表征

在20 mL錐形瓶中依次加入10 mL的去離子水，5 mL 的CTAB溶液(0.2 mol/L)，2 mL的氯金酸溶液(10 g/L)。攪拌均勻后，快速加入0.6 mL的硼氫化鈉溶液(0.01 mol/L)持續(xù)溫和攪拌，當(dāng)目測(cè)反應(yīng)體系顏色加深時(shí)，停止攪拌，于室溫條件下，靜置2 h后備用，此為金種液。

將19 mL的CTAB水溶液(0.2 mol/L)與1 mL的氯金酸溶液(10 g/L)充分混合，再加入0.2 mL的AgNO3溶液(0.01 mol/L)，攪拌均勻后，加入0.2 mL抗壞血酸溶液(0.1 mol/L)，將0.2 mL金種液加入到反應(yīng)體系中，靜置過(guò)夜，離心取沉淀，所得即為星狀金納米粒子。采用透射電子顯微鏡觀察金納米粒子的表觀形貌；采用紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定金納米粒子的特征吸收峰。采用激光粒度分布儀測(cè)定金納米粒子的粒徑分布。

1.3.2 聚谷氨酸的發(fā)酵制備

在37 ℃條件下活化枯草芽孢桿菌種子液，振蕩培養(yǎng) 18 h(150 r/min)。將活化后種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)液中(接種量為3%)，隨后繼續(xù)在37 ℃條件下振蕩培養(yǎng) 72 h。將發(fā)酵液離心去沉淀(4 000 r/min，30 min)，向上清液中加入無(wú)水乙醇(1∶2，體積比)，劇烈振蕩后得到絮狀沉淀物，離心取沉淀(4 000 r/min，30 min)， 用無(wú)水乙醇水溶液清洗2遍，置于真空干燥箱中下烘干備用，此為PGA固體粉末。

1.3.3 聚谷氨酸修飾金納米粒子的制備與表征

向20 mL所制備的金納米星體系中加入質(zhì)量濃度為10 mg/L的聚谷氨酸膠體溶液5 mL，室溫條件下溫和攪拌3 h(50 r/min)，然后離心去除上清液(4 000 r/min)，采用去離子水清洗沉淀2次，用以去除多余的聚谷氨酸膠體，真空干燥后所得固體即為聚谷氨酸修飾的金納米星(PGA-AuNPs)，采用去離子水稀釋備用，4 ℃條件下貯存。采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定PGA-AuNPs特征吸收峰。采用傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)PGA-AuNPs表面基團(tuán)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.3.4 不同pH條件下PGA-AuNPs的比色傳感

取2 mL PGA-AuNPs膠體(20 g/L)置于10 mL的離心管中，添加2 mL去離子水，再采用NaOH或HCl調(diào)節(jié)體系pH，總體系計(jì)為8 mL，采用去離子水補(bǔ)齊體系。充分混勻后，靜置10 min，觀察整個(gè)體系顏色的變化。

1.3.5 不同pH條件下PGA-AuNPs的熒光強(qiáng)度變化

取2 mL PGA-AuNPs膠體(20 g/L)置于10 mL的離心管中，添加2 mL去離子水，再采用NaOH或HCl調(diào)節(jié)體系pH，總體系計(jì)為8 mL，采用去離子水補(bǔ)齊體系。充分混勻后，靜置10 min，待顏色穩(wěn)定后，于3 mL 具塞比色皿中，準(zhǔn)確加入2.5 mL的該體系溶液，在熒光分光光度計(jì)上，設(shè)激發(fā)和發(fā)射光譜通帶為5.0 nm，以λex=λem方式進(jìn)行同步掃描，并在波長(zhǎng)430 nm處測(cè)定體系的熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 星狀金納米粒子的表征

本實(shí)驗(yàn)擬采用靜電吸附法，將帶有負(fù)電荷的聚谷氨酸修飾于所制備的金納米粒子表面，因此需要制備出表面帶有正電荷的金納米粒子。利用晶種生長(zhǎng)法，以CTAB作為還原劑和保護(hù)劑制備帶有正電荷的星狀金納米粒子。由圖1可知，采用晶種生長(zhǎng)法所制備的金納米粒子在紫外-可見(jiàn)光光譜中，于波長(zhǎng)527 nm處具有明顯的特征吸收峰，此為金納米粒子的表面等離子共振吸收峰，初步判定所制備的粒子為金納米星。

圖1 CTAB法制備的金納米星的紫外-可見(jiàn)光吸收光譜Fig.1 UV-VIS spectra of star likegold nanoparticles were prepared by CTAB method

采用透射電子掃描電鏡對(duì)所制備的金納米星的表觀形貌進(jìn)行表征。由圖2可知，CTAB晶種生長(zhǎng)法所制得的金納米粒子并非是圓球形，而是呈現(xiàn)五角星狀，且分布較為均勻，沒(méi)有出現(xiàn)明顯的團(tuán)聚的現(xiàn)象，目測(cè)粒徑大小 20～30 nm。

A-放大6 000倍；B-放大8 000倍圖2 CTAB法制備的金納米粒子的透射電子顯微鏡圖片F(xiàn)ig.2 TEM images of gold nanoparticles were prepared by CTAB method

至于金納米星的形成，是因?yàn)樵贑TAB還原而成的晶種生長(zhǎng)過(guò)程中，不同劑量的CTAB和AgNO3會(huì)改變晶種生長(zhǎng)的方向，以放射狀的形式累積，進(jìn)而生長(zhǎng)為星狀結(jié)構(gòu)。采用激光粒度分布儀測(cè)定金納米星的平均粒徑為(28.93±8.96) nm，采用電位儀測(cè)得金納米星表面電勢(shì)為21 mV，說(shuō)明其表面帶有正電荷。

2.2 PGA-AuNPs的制備與表征

由于金納米粒子與聚谷氨酸之間的靜電引力，當(dāng)提高聚谷氨酸的濃度并在加入的同時(shí)快速攪拌金納米星溶膠與聚谷氨酸的混合液時(shí)，金納米星表面的會(huì)被聚谷氨酸酸所取代，從而使金納米星表面的電荷發(fā)生偏轉(zhuǎn)，并穩(wěn)定存在于溶液中[20-22]。聚谷氨酸修飾前后的金納米星紫外-可見(jiàn)光光譜如圖3所示。由圖可知，聚谷氨酸修飾后金納米星的吸收峰發(fā)生紅移。一般研究認(rèn)為，隨著金納米粒子的粒徑增大，其紫外-可見(jiàn)吸收光譜峰展寬且向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，該結(jié)果說(shuō)明聚谷氨酸的修飾造成了金納米粒子粒徑的增大[21]，從一定意義上來(lái)講，聚谷氨酸已成功包覆在了金納米粒子的表面。

圖3 聚谷氨酸修飾前后紫外-可見(jiàn)光吸收光譜Fig.3 UV-VIS spectra of poly glutamic acid before and after modification

為進(jìn)一步確定聚谷氨酸是否修飾在金納米星的表面，采用紅外光譜表征其表面基團(tuán)結(jié)構(gòu)。由圖4可知，在PGA-AuNPs的紅外光譜中，分別在1 657和 1 597 cm-1處具有酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ特征峰。同時(shí)在1 628 和1 423 cm-1出現(xiàn)兩個(gè)峰，分別歸屬于-NH3+變形振動(dòng)峰和-COO-對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)吸收峰，在1 022.94 cm-1處有C-O伸展峰得到加強(qiáng)，說(shuō)明通過(guò)靜電作用PGA已成功修飾于金納米星的表面[21，23-25]。

圖4 PGA-AuNPs的傅立葉紅外光譜圖Fig.4 FTIR spectra of PGA-AuNPs

2.3 PGA-Au的pH響應(yīng)性研究

一般研究認(rèn)為，枯草芽孢桿菌的天然發(fā)酵產(chǎn)物γ-聚谷氨酸的等電點(diǎn)PI在4～5。而此類(lèi)聚谷氨酸的結(jié)構(gòu)對(duì)體系中的pH十分敏感。當(dāng)體系中的pH高于等電點(diǎn)時(shí)，聚谷氨酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生隨即卷曲[26-27]；而當(dāng)體系中的pH低于等電點(diǎn)時(shí)，結(jié)構(gòu)開(kāi)始逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楱?螺旋[27]。在結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的過(guò)程中，聚谷氨酸表面的電荷會(huì)發(fā)生反轉(zhuǎn)，導(dǎo)致具有不同電荷的聚谷氨酸產(chǎn)生靜電吸附，彼此聚集，正是根據(jù)此原理選擇聚谷氨酸修飾金納米粒子。不同的pH值能夠誘導(dǎo)聚谷氨酸的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而引起金納米粒子的組裝和去組裝，整個(gè)過(guò)程可以通過(guò)金納米星的顏色變化顯示出來(lái)，從而可以實(shí)現(xiàn)其對(duì)pH敏感響應(yīng)的目標(biāo)。設(shè)置pH值為1～12，加入PGA-Au納米粒子，反應(yīng)一段時(shí)間后，觀察顏色變化，見(jiàn)圖5。

圖5 PGA-AuNPs的pH響應(yīng)比色研究Fig.5 Study on pH response colorimetric of PGA-Au

由圖5可知，pH值為4時(shí)，為PGA-AuNPs的初始顏色，加入體系中后顏色幾乎沒(méi)有發(fā)生變化；pH值為3時(shí)，體系為酒紅色，粒徑相比于pH為4的體系時(shí)稍有減小，說(shuō)明當(dāng)pH低于等電點(diǎn)時(shí)，聚谷氨酸與金粒子解體，使得粒徑減小；當(dāng)pH值為1和2時(shí)，解離后的金納米星在聚谷氨酸的作用下迅速聚集，因此比色反應(yīng)體系為灰色；當(dāng)pH值為5～11時(shí)，顏色逐漸由淡紫色變?yōu)樽仙f(shuō)明pH高于等電點(diǎn)后，開(kāi)始改變聚谷氨酸的結(jié)構(gòu)，使得金納米粒子開(kāi)始緩慢聚集；當(dāng)pH值為12時(shí)，體系變?yōu)樗{(lán)灰色，粒子大量聚集成團(tuán)，形成沉淀。

一般研究表明，金納米粒子聚集后會(huì)使得表面等離子體共振散射強(qiáng)度衰弱，進(jìn)而引起熒光強(qiáng)度的減弱[21]。實(shí)驗(yàn)中采用熒光光譜評(píng)估金納米星在不同pH條件下的熒光強(qiáng)度變化，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 PGA-Au的pH響應(yīng)體系的熒光光譜圖Fig.6 Fluorescence spectra of PGA-Au pH response system

由圖可知，當(dāng)pH值為4時(shí)，PGA-AuNPs具有最強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，伴隨pH的變化，PGA-AuNPs的熒光強(qiáng)度逐漸發(fā)生衰退，其熒光強(qiáng)度的分布規(guī)律與比色體系中的基本一致。

3 結(jié)論

本研究采用CTAB法成功制備出表面帶正電荷的星狀金納米粒子，并利用天然發(fā)酵產(chǎn)物聚谷氨酸修飾金納米星，構(gòu)架出對(duì)pH敏感的新型納米材料。研究結(jié)果表明所制備的金納米星粒徑分布均勻，針對(duì)不同的pH會(huì)產(chǎn)生規(guī)律的變色，同時(shí)也會(huì)造成體系熒光強(qiáng)度的變化。根據(jù)此結(jié)果，可以使得所制備的pH敏感金納米星，應(yīng)用于諸多領(lǐng)域。本實(shí)驗(yàn)將為開(kāi)發(fā)新型pH敏感材料提供基本材料，為食品工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)的發(fā)展積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。