李曉寧 徐興陽(yáng) 范茂攀 楊青松 趙艷

摘要：為分析煙葉在生長(zhǎng)過(guò)程中的次生代謝物質(zhì)動(dòng)態(tài)變化特征、相關(guān)酶的活性變化規(guī)律，以3個(gè)烤煙種植試驗(yàn)點(diǎn)的烤煙為研究對(duì)象，研究不同葉位煙草葉片多酚類物質(zhì)含量、抗氧化活性和表達(dá)量。結(jié)果表明，同一個(gè)采樣點(diǎn)中，不同葉位煙葉多酚類物質(zhì)含量表現(xiàn)為上葉位>中葉位>下葉位。不同葉位煙草葉片PAL、PPO、C4H和4CL活性以上葉位最高。通過(guò)多酚體外抗氧化測(cè)定，表明不同葉位多酚對(duì)DPPH和羥基自由基有一定的清除能力。熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PAL基因和PPO基因在上葉位中的表達(dá)顯著高于其他葉位。烤煙生長(zhǎng)過(guò)程中的次生代謝物質(zhì)動(dòng)態(tài)變化，相關(guān)酶的活性變化及基因表達(dá)水平與煙葉成熟度存在一定的關(guān)聯(lián)。

關(guān)鍵詞：煙草;不同葉位;多酚;酶活性;抗氧化活性

中圖分類號(hào)：S572? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）09-0080-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.09.018? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： Aiming to analyze the dynamic changes of secondary metabolites and related enzymes during tobacco growth， the content， antioxidant activity and expression level of polyphenols in tobacco leaves at different leaf positions were studied in three tobacco planting experimental sites. In the same sampling site， the content of polyphenols in tobacco leaves of different leaf positions showed as follows：upper leaf position>middle leaf position>lower leaf position. The activities of PAL， PPO， C4H and 4CL in tobacco leaves at different positions showed that the enzyme activity in the upper leaves was the highest. The antioxidant activity of polyphenols in vitro showed that polyphenols in different leaf positions had certain scavenging ability to DPPH and hydroxyl free radicals. q-PCR analysis showed that the expression of PAL and PPO genes in the upper leaf was significantly higher than that of other leaf positions. Dynamic changes of secondary metabolites， enzyme activity and gene expression levels were correlated with tobacco maturity during the growth of flue-cured tobacco.

Key words： tobacco; different leaf positions; polyphenols; enzyme activity; antioxidant activity

煙草體內(nèi)的糖類、脂類和蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)代謝后產(chǎn)生了酚類化合物，存在于煙草葉片和煙氣中，在其生長(zhǎng)和發(fā)育、香氣味產(chǎn)生、產(chǎn)品調(diào)制、煙葉顏色和光澤等方面起著重要的作用[1，2]。煙草葉片的多酚類物質(zhì)主要包含蕓香苷、綠原酸和莨菪亭，其中含量較高的綠原酸和蕓香苷占煙葉總酚化合物含量的75%～95%[3]。

多酚類物質(zhì)是由芳香族氨基酸脫氨經(jīng)由肉桂酸和香豆素形成的，它是植物體中苯丙烷代謝途徑重要的代謝產(chǎn)物，多酚類物質(zhì)含量與煙草品質(zhì)形成有著緊密的聯(lián)系，研究表明多酚類物質(zhì)可提高煙草植株在逆境脅迫中抗逆能力和抗氧化水平[4-6]。Zucker等[7]研究表明多酚化合物在煙草植株的不同部位含量不同，葉中累積量較大，莖和根中累積量少。成熟煙株不同葉位的多酚含量從上部葉到下部葉逐漸降低，其中上部葉綠原酸含量最高，達(dá)到4.22%，下部葉綠原酸含量為3.14%，達(dá)到最低值[8]。

烤煙次生代謝在生態(tài)條件差異下，對(duì)煙草的內(nèi)在物質(zhì)含量及積累都有重要影響。在不同生態(tài)條件下，煙葉的內(nèi)在質(zhì)量相差很大，不同地區(qū)、不同品種其品質(zhì)相差很大，煙葉多酚不僅是衡量煙葉質(zhì)量的一個(gè)重要因子，與煙草植株的生長(zhǎng)及煙葉發(fā)育、抗逆性都有著相關(guān)性，影響煙葉多酚合成的因素包括煙葉部位、成熟度以及水分、溫度、濕度、日照、栽培措施等因子。研究發(fā)現(xiàn)煙株內(nèi)多酚類物質(zhì)可以在不同部位間轉(zhuǎn)移，綠原酸的合成可以在煙草葉片和莖中進(jìn)行，但根中不能合成，在開花時(shí)期的光周期誘導(dǎo)作用下，綠原酸在成熟植株中從上部轉(zhuǎn)移到根部[9]。多酚類化合物含量與煙葉等級(jí)相一致，等級(jí)高的煙葉多酚含量較高[10]，等級(jí)較好的煙葉中綠原酸和蕓香苷的含量也較高[2]，低等級(jí)煙葉的多酚含量低[10]。

酚類化合物在煙草生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，其生成過(guò)程和累積過(guò)程與相關(guān)酶類，包括多酚氧化酶（PPO）和過(guò)氧化物酶（POD）等生理活性有著緊密的聯(lián)系[11]。PPO是一種含有Cu2+的結(jié)構(gòu)蛋白，能進(jìn)行多酚類物質(zhì)上的羥基的催化，使之發(fā)生氧化反應(yīng)并轉(zhuǎn)化為醌，細(xì)胞內(nèi)的氨基酸與醌能發(fā)生聚合反應(yīng)形成色素產(chǎn)生沉淀[11]。前人的研究工作主要關(guān)注煙草調(diào)制過(guò)程中煙葉中多酚化合物及其相關(guān)酶的活性研究，但針對(duì)整個(gè)煙株生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程尚缺乏多酚類物質(zhì)的含量及其相關(guān)酶活性變化的關(guān)聯(lián)性研究分析。

本研究以云南省昆明3個(gè)烤煙種植試驗(yàn)點(diǎn)的烤煙為研究對(duì)象，研究品種與不同葉位間多酚類物質(zhì)積累的差異，探討提高煙葉品質(zhì)的最適效應(yīng)。考察不同葉位煙草葉片多酚類物質(zhì)含量，分析其抗氧化活性和表達(dá)量，以期為煙草種植、煙葉生產(chǎn)管理及煙葉品質(zhì)提高提供參考。進(jìn)一步掌握次生代謝產(chǎn)物對(duì)煙葉的品質(zhì)影響，為合理調(diào)控?zé)熑~的發(fā)育進(jìn)程提供理論依據(jù)與技術(shù)支撐。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料

以云南省昆明烤煙為研究對(duì)象，分別選取宜良縣和石林縣的3個(gè)烤煙種植試驗(yàn)點(diǎn)，供試材料品種為紅花大金元（宜良縣）和K326（石林縣）。采摘成熟期煙草葉片，根據(jù)葉片（上部葉片完全展開，下部葉片不失綠）在莖稈上的著生位置，從上到下依次為上、中、下葉位。采樣具體信息見表1。

1.2? 試驗(yàn)方法

1.2.1? 多酚類物質(zhì)含量測(cè)定? 取樣后干燥煙草葉片，粉碎后過(guò)80目篩。稱取4 g煙草樣品在提取溫度75 ℃、乙醇濃度（V/V）50%、液料比20 mL/g提取條件下回流提取50 min，提取完畢后趁熱過(guò)濾，待濾液冷卻至室溫后用提取溶劑定容至100 mL，得煙草多酚提取液。

根據(jù)Folin-Ciocalte法，繪制沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定樣品的吸光度，計(jì)算煙草提取液中多酚提取率。煙草多酚提取液中多酚濃度可由沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算得出，并按照公式得出煙草多酚提取率。

式中，C為多酚濃度（mg/mL）;Va為容量瓶量程（100 mL）;Vb為提取液總體積（100 mL）;M為樣品質(zhì)量（4 g）;V為取液量（10 mL）。

1.2.2? 酶活性測(cè)定? 采用紫外分光光度法利用 PAL活性測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）測(cè)定苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL）活性，肉桂酸-4-羥化酶（Cinnamic acid 4-hydroxylase，C4H）和4-香豆酸連接酶（4-coumarate-CoA ligase，4CL）活性參照Kong等[12]的方法測(cè)定。

1.2.3? 抗氧化活性測(cè)定

1）不同濃度提取液的配制。將煙草多酚提取液稀釋成多酚濃度梯度為0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006 mg/mL的溶液。配制濃度梯度為0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006 mg/mL的維生素C溶液。

2）測(cè)定DPPH清除率。DPPH無(wú)水乙醇溶液為紫色，被還原時(shí)退色，且退色程度與清除率呈正比，在517 nm處有特征吸收。以維生素C為對(duì)照，測(cè)定煙草不同葉位多酚對(duì)DPPH的清除能力。

根據(jù)李西柳等[13]的方法測(cè)定。測(cè)定清除DPPH的能力，先配制0.2 mmol/L DPPH無(wú)水乙醇溶液于棕色瓶中并于0～4 ℃保存。分別準(zhǔn)確量取上述溶液2 mL于試管中，再加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH無(wú)水乙醇溶液，室溫下反應(yīng)30 min;將DPPH無(wú)水乙醇溶液和煙草多酚溶液用等濃度乙醇置換，重復(fù)上述步驟，在517 nm處測(cè)定吸光度X1、X2和X0。重復(fù)兩次取平均值，根據(jù)公式計(jì)算：

3）測(cè)定羥基自由基清除率。生物體內(nèi)活性最強(qiáng)的氧自由基是羥基自由基，所以評(píng)價(jià)抗氧化活性的重要指標(biāo)之一就是清除羥基自由基的能力。以維生素C為對(duì)照，測(cè)定煙草不同葉位多酚對(duì)羥基自由基的清除能力。

根據(jù)吳林秀等[14]的方法測(cè)定。采用的水楊酸鈉絡(luò)合法測(cè)定，先分別準(zhǔn)確量取上述溶液2 mL于試管中，再加入9 mmol/L FeSO4和9 mmol/L H2O2各2 mL于試管室溫下反應(yīng)20 min。然后分別加入9 mmol/L水楊酸鈉溶液2 mL室溫下反應(yīng)20 min。將水楊酸鈉溶液和煙草多酚溶液用等量蒸餾水置換，重復(fù)上述步驟，在510 nm處測(cè)定吸光度X1、X2和X0。重復(fù)兩次取平均值，根據(jù)公式計(jì)算：

4）引物設(shè)計(jì)及表達(dá)量測(cè)定。對(duì)各處理樣品的cDNA模板進(jìn)行PAL基因表達(dá)量的測(cè)定。RT-qPCR體系按照SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa）操作指南進(jìn)行。熒光定量使用Master cycler ep realplex 2S（Eppendorf）。使用Real Time PCR熒光定量?jī)x進(jìn)行相對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR。擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL∶10 μL SYBR Premix Ex TaqTMⅡ，5 μL（50 ng/L） cDNA 模板，正、反引物各1 μL，3 μL ddH2O。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)，72 ℃單點(diǎn)檢測(cè)信號(hào)。以煙草Actin作為內(nèi)參基因，每個(gè)樣品RT-qPCR采用3 次重復(fù)，運(yùn)用2-ΔΔCT算法分析各基因的表達(dá)量。

根據(jù)qRT-PCR引物設(shè)計(jì)的要求，采用Primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（表2）。以Actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT法進(jìn)行基因相對(duì)定量分析。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行LSD多重比較法方差分析，Excel和Origin 9.1軟件制作圖表。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 不同葉位煙葉的多酚提取率

從圖1可以看出，宜良縣3個(gè)采樣點(diǎn)的9個(gè)樣品，不同葉位煙草葉片多酚提取率存在著明顯差異，其中1號(hào)采樣點(diǎn)的3號(hào)樣（上葉位）的多酚提取率最高，是同個(gè)采樣點(diǎn)的中葉位和下葉位提取率的1.29和1.78倍。

從圖2可以看出，石林縣3個(gè)采樣點(diǎn)的9個(gè)樣品，不同葉位煙草葉片多酚提取率存在著明顯差異，其中3號(hào)采樣點(diǎn)的18號(hào)樣（上葉位）的多酚提取率最高，是同個(gè)采樣點(diǎn)的中葉位和下葉位提取率的1.61和1.67倍。

2.2? 不同葉位煙草葉片PAL、PPO、C4H和4CL活性分析

由圖3可知，不同葉位煙草葉片PAL活性隨著葉位的不同呈現(xiàn)不同的趨勢(shì)，其中宜良縣和石林縣所有采樣點(diǎn)上葉位PAL活性均大于中葉位和下葉位。宜良縣3號(hào)采樣點(diǎn)的9號(hào)樣和石林縣3號(hào)采樣點(diǎn)的18號(hào)樣PAL活性明顯高于其他葉位。

由圖4可知，不同葉位煙草葉片PPO活性隨著葉位的不同呈現(xiàn)不同的趨勢(shì)，其中宜良縣和石林縣所有采樣點(diǎn)上葉位PPO活性均大于中葉位和下葉位。宜良縣3號(hào)采樣點(diǎn)的9號(hào)樣和石林縣3號(hào)采樣點(diǎn)的18號(hào)樣PAL活性明顯高于其他葉位。

由圖5可知，不同葉位煙草葉片C4H活性隨著葉位的不同呈現(xiàn)不同的趨勢(shì)，其中宜良縣和石林縣所有采樣點(diǎn)上葉位C4H活性均大于中葉位和下葉位。宜良縣3號(hào)采樣點(diǎn)的9號(hào)樣和石林縣3號(hào)采樣點(diǎn)的18號(hào)樣C4H活性明顯高于其他葉位。

由圖6可知，不同葉位煙草葉片4CL活性隨著葉位的不同呈現(xiàn)不同的趨勢(shì)，其中宜良縣和石林縣所有采樣點(diǎn)上葉位4CL活性均大于中葉位和下葉位。宜良縣的3號(hào)樣和9號(hào)樣及石林縣的12號(hào)樣和18號(hào)樣4CL活性明顯高于其他葉位。

2.3? 不同葉位煙葉多酚體外抗氧化結(jié)果

2.3.1? 清除DPPH結(jié)果與分析? 由表3可知，隨著不同葉位煙葉多酚提取液和維生素C濃度的增加，對(duì)DPPH的清除率也在逐漸增大，呈現(xiàn)出濃度依賴性。經(jīng)計(jì)算煙葉多酚提取液的IC50為0.0019 mg/mL。當(dāng)18號(hào)樣品濃度到達(dá)0.006 mg/mL時(shí)，其清除率可達(dá)到80.94%，當(dāng)濃度到達(dá)0.005 mg/mL以后，對(duì)DPPH的清除率趨于穩(wěn)定;而維生素C的IC50為0.000 6 mg/mL，IC50越小表示其抗氧化能力越強(qiáng)，說(shuō)明不同葉位煙葉多酚對(duì)DPPH有一定的清除能力，但清除能力較維生素C稍弱。

2.3.2? 清除羥基自由基結(jié)果與分析? 由表4可知，隨著煙草葉片多酚提取液和維生素C濃度的增加，對(duì)羥基自由基的清除率也在逐漸增大，呈現(xiàn)出濃度依賴性。經(jīng)計(jì)算煙葉多酚提取液的IC50為0.003 7 mg/mL。當(dāng)18號(hào)樣品濃度到達(dá)0.006 mg/mL時(shí)，其清除率可達(dá)78.67%，當(dāng)濃度到達(dá)0.005 mg/mL以后，對(duì)羥基自由基的清除率趨于穩(wěn)定;而維生素C的IC50為0.000 6 mg/mL，IC50越小表示其抗氧化能力越強(qiáng)，說(shuō)明不同葉位煙葉多酚對(duì)羥基自由基有一定的清除能力，但清除能力較維生素C稍弱。

2.4? 不同葉位煙葉PAL和PPO基因表達(dá)分析

熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PAL基因主要在上部葉中的表達(dá)量最高，其次是在中部葉，下部葉中的表達(dá)量最低（圖7）。隨著葉位的不同呈現(xiàn)不同的表達(dá)趨勢(shì)。其中，宜良縣采樣點(diǎn)的3號(hào)樣、9號(hào)樣和石林縣的18號(hào)樣PAL基因表達(dá)顯著高于其他葉位。PPO基因均在上部葉中的表達(dá)量最高，表達(dá)量最低的葉位是下葉位（圖8），宜良縣采樣點(diǎn)的3號(hào)樣、6號(hào)樣和9號(hào)樣與石林縣采樣點(diǎn)的12號(hào)樣、15號(hào)樣和18號(hào)樣PPO基因在上葉位中的表達(dá)明顯高于其他葉位。

3? 小結(jié)與討論

成熟度是決定煙草品質(zhì)的一個(gè)主要因素，研究表明由于成熟度差異煙葉中內(nèi)含物累積的不同，影響著原煙產(chǎn)品質(zhì)量和品質(zhì)，成熟度不同的煙葉，其多酚化合物含量有明顯的差異[15，16]。王丹等[17]研究了2個(gè)烤煙品種在不同成熟期多酚化合物及氧化酶活性的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著煙葉的成熟，葉片中的多酚和抗壞血酸的含量逐漸升高，多酚氧化酶和過(guò)氧化物酶活性在適熟時(shí)達(dá)到最高。

由于不同地區(qū)的環(huán)境影響因素不同，使在不同地區(qū)種植同一煙草品種時(shí)，會(huì)存在生長(zhǎng)狀態(tài)和內(nèi)部化學(xué)成分含量差異的情況。煙葉在發(fā)育過(guò)程中，其多酚化合物含量隨著煙葉的成熟度變化，煙葉過(guò)熟時(shí)多酚化合物含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。本研究結(jié)果表明，不同葉位煙葉多酚類物質(zhì)含量呈現(xiàn)出上葉位較高趨勢(shì)，中葉位次之，下葉位葉片的多酚類物質(zhì)含量最低。通過(guò)測(cè)定不同葉位煙草葉片PAL、PPO、C4H和4CL活性，結(jié)果表明上葉位、中葉位和下葉位煙草葉片的酶活性隨著葉位的不同呈現(xiàn)出不同的趨勢(shì)。相關(guān)研究表明，青黃葉、大葉黃和大白花3個(gè)品種中，苯丙氨酸解氨酶活性與綠原酸和蕓香苷的變化規(guī)律相同，多酚氧化酶活性和過(guò)氧化物酶活性呈單峰趨勢(shì)。孟莉等[18]的研究發(fā)現(xiàn)多酚氧化酶活性在煙葉生長(zhǎng)過(guò)程中和總酚的含量呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，過(guò)氧化物酶活性與總酚的含量呈現(xiàn)出正相關(guān)趨勢(shì)。袁衛(wèi)瑜等[19]發(fā)現(xiàn)打頂后能提高煙葉多酚類物質(zhì)的含量，煙葉成熟度增加后，中部葉的多酚總量提高，而上部葉多酚總量下降，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)中部葉和上部葉的PAL活性與其他酚類物質(zhì)含量均呈正相關(guān)，PPO活性與酚類物質(zhì)含量均呈負(fù)相關(guān)。打頂誘導(dǎo)煙葉多酚生物合成與生育期有關(guān)，楊銀菊等[20]發(fā)現(xiàn)苗期打頂后，煙葉中多酚含量降低，而現(xiàn)蕾后打頂煙葉中多酚含量升高。

在煙草生長(zhǎng)過(guò)程中，多酚是植物中重要的次生代謝產(chǎn)物和生物活性物質(zhì)，煙葉中多酚含量的變化與煙株生長(zhǎng)狀態(tài)密切相關(guān)，其中光是影響植物多酚含量的重要非生物因素，從煙草K326中分離到光敏色素B同系物NTFYB1，分析了其光受體在煙草多酚代謝調(diào)控中的作用，結(jié)果表明NtPHYB1參與煙草葉片多酚代謝的調(diào)節(jié)，其表達(dá)有利于綠原酸及其異構(gòu)體的積累，同時(shí)NtPHYB1可調(diào)節(jié)PAL4、4CL1和COMT基因的轉(zhuǎn)錄[21]。

同一個(gè)采樣點(diǎn)中，不同葉位煙葉多酚類物質(zhì)含量表現(xiàn)為上葉位>中葉位>下葉位。不同葉位煙草葉片PAL、PPO、C4H和4CL活性結(jié)果表明，上葉位的酶活性最高。通過(guò)多酚體外抗氧化測(cè)定，表明不同葉位多酚對(duì)DPPH和羥基自由有一定的清除能力。熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PAL基因和PPO基因在上葉位的表達(dá)明顯高于其他葉位。

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收稿日期：2018-09-30

基金項(xiàng)目：中國(guó)煙草總公司云南省公司重點(diǎn)資助項(xiàng)目“基于品牌導(dǎo)向的煙葉定向需求技術(shù)研究與應(yīng)用”（2017YN12）

作者簡(jiǎn)介：李曉寧（1981-），女，山西大同人，講師，碩士，主要從事土壤化學(xué)的研究工作，（電話）0871-65227651（電子信箱）14576221@qq.com;通信作者，趙? 艷（1982-），女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，博士，主要從事生物化學(xué)的研究工作，（電話）0871-65220462（電子信箱）zhaoyankm@126.com。