汪 旭，張 鑫，馬曉娟，郝雪琴

NOD樣受體蛋白3 (nod-like receptor 3, NLRP3) 是一種多蛋白復(fù)合物，參與caspase-1依賴的白細胞介素IL-1樣促炎細胞因子的釋放。NLRP3通過組件組裝成炎癥小體結(jié)構(gòu)激活，對損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMP)或病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)的細胞內(nèi)識別，進而結(jié)合ASC(apoptosis speck-like protein)導(dǎo)致caspase-1的招募和自切割活化，促進細胞因子前體IL-1α，pro-IL-1β，IL-33和pro-IL-18的成熟和分泌[1]。DAMPs是宿主生物分子，它能引起非感染性炎癥反應(yīng)。相反，PAMPs引起病原體感染性炎癥反應(yīng)。細菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭氏陰性桿菌細胞膜上發(fā)現(xiàn)的內(nèi)毒素，被認為是一種典型的PAMPs[2]。據(jù)報道，微生物感染引起caspase-1依賴的抗菌反應(yīng)觸發(fā)炎癥小體復(fù)合物的組裝[3]。黃芩苷(Baicalin,BA)具有抗氧化、抗焦慮作用，廣泛用于治療感染性和炎性疾病，可以預(yù)防急性肝損傷、實驗性牙周炎和敗血癥[4]。本研究采用LPS誘導(dǎo)大鼠炎癥反應(yīng)，探討黃芩苷對腎、睪丸、腦、肺急性損傷的保護作用?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料動物：40只Sprague-Dawley雄性大鼠購自華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院動物培養(yǎng)中心，動物許可證號：SCXK(鄂)2010-0007。試劑：IL-1β和IL-18 ELISA試劑盒(美國R&D Systems公司，RLB00)；免疫組化SABC檢測試劑盒(SA1020)、NLRP3抗體(BA3677)、DAB試劑盒(武漢博士德生物有限公司，AR1022)。儀器：全波長酶標儀(美國伯騰儀器有限公司，Epoch)；輪轉(zhuǎn)切片機(德國Leica公司，RM-2235)；Carl Zeiss顯微鏡(蘇州卡爾蔡司有限公司，Axio Scope A1)。

1.2 分組、造模及給藥動物在室溫(24±1) ℃和12 h的黑暗條件下自由進食實驗大鼠標準飼料和純凈水。適應(yīng)2周后，40只大鼠隨機分為5組，每組8只，分別為對照組、LPS組、黃芩苷40 mg組、黃芩苷80 mg組和黃芩苷160 mg組。LPS組大鼠第1、3、5 d腹腔注射LPS 0.79 mg·kg-1；黃芩苷組大鼠第1、3、5 d腹腔注射LPS 0.79 mg·kg-1，然后分別給予黃芩苷40、80和160 mg·kg-1，連續(xù)灌胃7 d；對照組大鼠灌胃生理鹽水[5]。第12天采集樣本。本研究得到河南科技大學(xué)當?shù)貏游飩惱砦瘑T會的批準。

1.3 血清IL-1β和IL-18濃度的測量用戊巴比妥(40 mg·kg-1)麻醉大鼠。取腹主動脈血，置于室溫30 min，然后3 000 r·min-1離心15 min，取上清。分別使用大鼠IL-1β和IL-18 ELISA試劑盒測量血清IL-1β和IL-18的濃度，使用酶標儀讀取數(shù)據(jù)。

1.4 組織形態(tài)改變大鼠經(jīng)0.9% NaCl和4%多聚甲醛全身灌注后，收集腎臟、睪丸、腦組織和肺組織，4%多聚甲醛溶液中浸泡48 h，脫水后石蠟包埋；4 μm組織切片進行HE染色，光鏡下觀察腎臟、睪丸、腦組織和肺組織的形態(tài)學(xué)變化。

1.5 NLRP3免疫組化腎、睪丸、腦和肺組織在4%多聚甲醛中浸泡24 h，石蠟包埋。切片(4 μm)在PBS中沖洗5 min，然后進行免疫組化染色，使用免疫組化過氧化物酶檢測試劑盒檢測。使用DAB試劑盒觀察過氧化物酶活性。采用Image-pro plus軟件定量計算每組圖片中NLRP3蛋白的表達 (integral optical density,IOD)。

2 結(jié)果

2.1 黃芩苷對IL-18和IL-1β的影響LPS 組血清IL-1β和IL-18濃度高于對照組；黃芩苷40 mg組和黃芩苷80 mg組與LPS組相比無顯著性差異；與LPS組相比，黃芩苷160 mg組血清IL-1β和IL-18濃度較低。黃芪苷治療可減輕LPS誘導(dǎo)的大鼠血清IL-1β和IL-18濃度。見表1。

表1 黃芩苷對IL-18和IL-1β的影響

注：①與對照組相比較，P<0.05；②與LPS組相比較，P<0.05。

2.2 黃芩苷對大鼠腎臟形態(tài)學(xué)變化的影響與對照組相比，LPS組的腎小囊間隙增大，腎間質(zhì)炎癥細胞浸潤；黃芩苷160 mg組腎小囊腔有所改善，腎間質(zhì)未見明顯炎癥細胞浸潤。黃芪苷治療可減輕LPS誘導(dǎo)的腎形態(tài)學(xué)損傷。

2.3 黃芩苷對大鼠睪丸的影響與對照組相比，LPS組睪丸生精小管基底膜破壞，精原細胞與初級精母細胞之間的間隙增大，生精細胞的數(shù)量減少，排列不規(guī)則；黃芩苷160 mg組生精小管基底膜完整，生精細胞排列規(guī)則。黃芪苷治療可以以劑量依賴性的方式緩解LPS誘導(dǎo)的睪丸損傷。

2.4 黃芩苷對大鼠腦的形態(tài)學(xué)變化的影響LPS組皮質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量少于對照組，細胞排列混亂，無明顯邊界，在細胞核周圍有很大的空泡，細胞核和細胞質(zhì)染色較淺；黃芪苷80 mg組和160 mg組神經(jīng)元細胞排列規(guī)則，腦細胞內(nèi)未見明顯大液泡。黃芩苷治療可以以劑量依賴性的方式減輕LPS引起的腦損傷。

2.5 黃芩苷對大鼠肺的形態(tài)學(xué)變化的影響與對照組相比，LPS組肺泡壁腫脹、變厚，炎性細胞浸潤，伴有間質(zhì)組織充血、水腫；黃芩苷160 mg組肺泡壁無充血、水腫，未見明顯炎細胞浸潤。黃芩苷治療可以劑量依賴性的方式緩解LPS誘導(dǎo)的肺損傷。

2.6 黃芩苷對NLRP3蛋白表達的影響NLRP3蛋白主要表達在腎小管上皮細胞的細胞質(zhì)、睪丸的生殖細胞和精子的細胞核、大腦神經(jīng)元的細胞質(zhì)和肺泡上皮細胞的細胞質(zhì)中。黃芩苷對大鼠各組織器官NLRP3蛋白表達的影響見表2。與對照組相比，LPS組腎、睪丸、腦、肺中NLRP3蛋白表達顯著增加；黃芪苷(40、80或160 mg·kg-1)治療可減少NLRP3蛋白在腎臟(圖1)、睪丸(圖2)、大腦(圖3)和肺(圖4)中的表達。

表2 黃芩苷對大鼠各組織器官NLRP3蛋白表達的影響

注：①與對照組相比較，P<0.05；與LPS組相比較，②P<0.05。

圖1 黃芩苷減少LPS誘導(dǎo)的大鼠腎臟NLRP3蛋白的表達(SP，×400)

圖2 黃芩苷減少LPS誘導(dǎo)的大鼠睪丸NLRP3蛋白的表達(SP，×400)

圖3 黃芩苷減少LPS誘導(dǎo)的大鼠腦NLRP3蛋白的表達(SP，×400)

圖4 黃芩苷減少LPS誘導(dǎo)的大鼠肺NLRP3蛋白的表達(SP，×400)

3 討論

細菌脂多糖是革蘭氏陰性桿菌細胞膜上發(fā)現(xiàn)的內(nèi)毒素，細菌內(nèi)毒素具有廣泛的生物學(xué)活性，脂多糖是內(nèi)毒素的毒性核心，也是細菌的主要致病因子。內(nèi)毒素進入機體后，會對宿主細胞產(chǎn)生一定的毒性作用，引起機體多種急慢性炎癥反應(yīng)，對組織造成炎性損傷[6]。NLRP3在正常細胞中有表達，炎癥刺激如LPS時激活，NLRP3炎性小體激活不當可導(dǎo)致多種疾病的進展[7-8]。新的研究表明，NLRP3炎性小體參與了腎臟炎癥[9]、足細胞損傷和高同型半胱氨酸血癥腎小球硬化的誘導(dǎo)[10]；NLRP3可抑制睪丸類固醇的生成，擾亂精子生成，導(dǎo)致睪丸功能障礙[11]；NLRP3的激活會導(dǎo)致LPS暴露動物的長期行為改變。NLRP3可直接或間接損傷肺泡上皮細胞和毛細血管內(nèi)皮細胞[12]。

黃芩是一味常用的中藥，它的有效部位是根部，黃芩的干燥根富含多種黃酮類化合物，可提取多種生物活性物質(zhì)。黃芩苷是主要的活性成分，具有廣泛的藥理作用，黃芩苷具有抗氧化、抗炎作用[13-14]。研究表明，在副豬嗜血桿菌感染期間，黃芩苷呈劑量依賴性的方式抑制NLRP3炎癥小體和NF-κB信號[8]，可防止大鼠的睪丸蒂扭轉(zhuǎn)。黃芩苷可能通過抗炎和抗凋亡機制減輕缺血導(dǎo)致的神經(jīng)元細胞損傷。黃芩苷降低血腦屏障通透性，有效降低腦出血后腦水腫[15]。研究表明，黃芩苷可能會降低IL-1β的水平，減輕缺血再灌注引起的腎損傷[4]。此外，黃芩苷還能減輕空氣栓塞所致急性肺損傷[12]。

本研究在大鼠腹腔注射LPS后，LPS組血清IL-18，IL-1β水平高于對照組，腎、睪丸、腦、肺中NLRP3蛋白表達均高于對照組，LPS組腎小囊腔增大，睪丸生精細胞減少，腦細胞內(nèi)大液泡、肺泡壁腫脹、增厚。表明由于LPS炎癥刺激誘導(dǎo)的NLRP3在大鼠多個器官的表達，IL-1β和IL-18炎性因子的釋放，導(dǎo)致大鼠多個器官急性損傷?？赡苁荖LRP3的表達增強了大鼠多個器官的炎性作用，從而使組織發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)損傷。

黃芩苷治療后IL-1β和IL-18 細胞因子水平和各組織器官中NLRP3的水平呈劑量依賴性地下降，其中黃芩苷160 mg組血清IL-18、IL-1β水平和腎、睪丸、腦、肺中NLRP3水平明顯低于LPS組。黃芩苷160 mg組腎間質(zhì)未見明顯炎細胞浸潤，睪丸生精小管基底膜完整，腦細胞內(nèi)未見大液泡，肺泡壁無明顯腫脹。提示黃芪苷在多個器官中抑制NLRP3的表達，并減少caspase-1依賴的IL-1β和IL-18 細胞因子的釋放，以及隨后的炎癥反應(yīng)，減緩了炎癥刺激引起的組織損傷作用，有效地減輕組織形態(tài)損傷及病理學(xué)改變。因此，可以得出結(jié)論，黃芩苷能保護大鼠腎臟、睪丸、腦和肺免受LPS誘導(dǎo)的急性損傷，其機制可能與抑制NLRP3的表達有關(guān)。