王小利 ，許德英，孫真真，白嬌紅，艾紅偉，常永超

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤，也是導致癌癥相關死亡的第二大原因[1]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是原癌基因c-erbB1的表達產物，與細胞的生長、增殖和分化等過程密切相關，也是多種腫瘤的重要靶標分子。p53是一種編碼核磷酸蛋白的重要抑癌基因，但其突變會導致癌變。ki-67是一種與細胞周期密切相關的核蛋白，可判斷腫瘤的增殖情況，并在乳腺癌的臨床預后中有重要意義[2]。雄激素受體(androgen receptor，AR)是類固醇激素受體家族中的一員，也是一種細胞內轉錄因子，對乳腺癌的診治存在臨床價值。目前乳腺癌的診療分子標志物有多種，但對聯合檢測乳腺癌的分子靶標評價報道還較少，且一般認為一期乳腺癌的5 a治愈率90%～95%，二期約70%～80%，三期約50%～60%，四期則低于10%，而臨床中四期患者較少，所以作者隨訪時間均超過5 a。本研究主要通過免疫組化(immunohistochemistry，IHC)方法檢測乳腺癌組織中EGFR、p53、ki-67及AR等分子標志物的表達，分析其與患者臨床病理特征間的關系，并探討其對乳腺癌患者的臨床預后意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料組織芯片購于上海芯超生物科技公司，共145例樣本，手術時間為2005年8月至2009年12月，隨訪至2015年7月，隨訪時間5.6～10 a，中位生存時間77(2～119)個月，術前均未接受乳腺相關治療，病史資料完整，均為女性，中位年齡59.50(33～88)歲，HE染色驗證其符合組織病理學特征。

1.2 主要試劑抗ER、PR、Her-2、EGFR、p53、Ki67及AR抗體均購自北京中杉金橋生物公司。

1.3 IHC方法操作步驟嚴格按照生物素—鏈霉卵白素免疫組化檢測試劑盒(無錫傲銳東源)說明書進行，抗原修復采用高壓修復法，陰性對照為PBS磷酸緩沖液代替一抗。

1.4 FISH方法按照熒光原位雜交技術(fluorescent in situ hybridazation，FISH)檢測試劑盒(廣州安必平)進行操作，Her-2/CEP17比率大于2.2定義為HER2基因擴增。

1.5 結果判斷評判標準參照許良中的評價標準[3]，隨機觀察不重復的高倍(×200)視野4～5個，計數100～200個腫瘤細胞；染色境界清晰、背景突出的棕黃色或棕褐色顆粒定義陽性細胞；根據陽性細胞數量及著色程度進行半定量分析。陽性細胞數量：陽性細胞<1%，計0分；1%≤陽性細胞數≤30%，計1分；31%≤陽性細胞數≤70%，計2分；71%≤陽性細胞數≤100%，計3 分；著色程度：0分為不著色；1分為淺棕色；2分為棕黃色；3分為棕揭色。兩項分數累計相加：<3分為陰性(-)，≥3分為陽性(+)，分為兩組進行分析；Ki67陽性定義為癌細胞核著色≥20%[4-5]；HER-2陽性為IHC染色強度≥5分和/或FISH檢測HER-2基因擴增，陰性為IHC染色強度<3分和(或)FISH檢測HER-2基因無擴增。

1.6 分型標準分子分型標準為2013年第十三屆St.Gallen國際乳腺癌會議專家共識[4-5]，即：①Luminal A型：免疫組織化檢測結果為ER陽性和/或PR陽性，Her-2陰性，Ki67<20%；②Luminal B型：ER陽性和/或PR陽性，Her-2陽性；或ER陽性和/或PR陽性，Her-2陰性，ki-67≥20%；③Her-2過表達型：ER、PR陰性，Her-2陽性，ki-67多為高表達；④Basical-like型：ER、PR陰性/Her-2陰性。本組研究對象145例乳腺癌，其中Luminal A型44例，Luminal B型32例，Her-2過表達型30例，Basical-like型38例。

1.7 統計學方法應用SPSS 19.0 及Graphpad Prism7.0軟件進行統計學分析。采用Fisher 確切檢驗或χ2檢驗分析蛋白表達與臨床病理特征之間的關系。Cox風險回歸比例模型分析影響乳腺癌預后的獨立危險因素。Kaplan-Meier 法計算生存曲線，單因素生存曲線采用Log-rank方法比較差異性，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EGFR、p53、ki-67及AR的表達IHC結果顯示EGFR陽性表達定位于細胞核、細胞質及細胞膜，是一種分泌性蛋白；p53、ki-67及AR定位于細胞核，見圖1。EGFR、p53、ki-67及AR在乳腺癌組織中的陽性表達分別為41.38%(60/145)、72.41%(105/145)、36.55%(53/145)及55.86%(81/145)，見表1。

2.2 EGFR、p53、ki-67及AR表達與臨床病理特征的關系在145例乳腺癌組織中，EGFR、ki-67的表達與病理學分級及分子亞型間差異有統計學意義(P<0.05)，而與年齡大小、腫物大小以及淋巴結有無轉移無統計學意義(P>0.05)；p53的表達則與年齡大小、腫物大小、淋巴結有無轉移、病理學分級及分子分型分類間差異均無統計學意義(P>0.05)；AR的表達則除了與年齡大小間的差異無統計學意義(P>0.05)外，與其余4種臨床病理特征間差異均有相關性，有統計學意義(P<0.05)，見表1。

D圖為FISH法檢測Her-2基因擴增(×1 000)，其余圖均為IHC法檢測(×200)。圖1 ER、PR、Her-2、EGFR、p53、ki-67及AR陽性表達情況

2.3 EGFR、p53、ki-67及AR與乳腺癌的預后Cox多因素回歸分析顯示EGFR的差異性表達可作為影響乳腺癌患者的獨立預后因素，差異有統計學意義(P<0.05，HR=1.55，95%Cl=1.02～2.36)，見表2。而K-M曲線顯示EGFR、p53、ki-67及AR的差異性表達與腫瘤的累計生存率均無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

3 討論

基因組研究分析發(fā)現，乳腺癌是一種異質性疾病。根據分子表型可將乳腺癌分為4類[4-5]，治療措施也各不相同，故研究不同分子標志物在各類分子亞型乳腺癌中的表達意義非常重要，且Basical-like型乳腺癌與三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)約有80%的重合，而TNBC又具備局部復發(fā)率高、侵襲性強、遠處轉移早且預后差等特征。

表2 Cox風險比例模型分析影響乳腺癌患者獨立預后因素

A:EGFR; B:p53; C:ki-67; D:AR。圖2 K-M法計算EGFR、p53、ki-67、AR在乳腺癌中的累計生存率

EGFR是一種表皮生長因子受體，在多種腫瘤中常異常表達。該研究顯示EGFR在乳腺癌中的總體陽性率為41.38%，在Her-2過表達和Basical-like型中的陽性表達率高達73.33%和78.95%，而在Luminal型乳腺癌中的表達率很低，提示EGFR對Her-2過表達和Basical-like型乳腺癌的發(fā)生發(fā)展可能起重要作用。且EGFR可作為乳腺癌預后的獨立危險因素，這可能與EGFR異常表達的生物學特性，即促使癌細胞增殖、血管生成、轉移、抑制凋亡等有關。所以EGFR表達水平或基因突變狀態(tài)越來越多地被用于乳腺癌患者的靶向治療。

p53是一種重要的抑癌基因。有研究表明，20%～35%的乳腺癌均存在p53基因突變，在TNBC中的突變率更高[6]。本研究顯示在乳腺癌中p53的陽性表達率達72.41%，在Her-2過表達和Basical-like型中的陽性表達率高達73.33%和86.84%，但p53的差異性表達與乳腺癌的臨床病理特征均不存在相關性，這可能是由于在大多數腫瘤中p53基因突變率較高但特異性較差的緣故，也有可能由于本次研究樣本例數較少。

ki-67是一種與細胞增殖密切相關的核蛋白，也是Luminal B型乳腺癌分型的分子依據之一。本研究中ki-67的陽性表達率36.55%，在Luminal B型和Basical-like型中的表達率為69.70%和55.26%，差異有統計學意義，但與年齡、腫瘤大小和有無遠處轉移無相關性；但在TNBC中，有報道稱ki-67高表達與腫瘤大小及淋巴結轉移有顯著相關性，而與年齡、臨床分期無相關性，且提示Ki67可能是TNBC患者預后不良的一個指標[7-8]，由于本次TNBC樣本數有限，并未做該方面的研究。

AR是雄激素受體，在本研究中陽性表達率為55.86%，與Chen C等[9]報道的陽性率基本一致，且腫瘤越大、病理學分級越高、有遠處轉移的乳腺癌患者AR的表達率越高。McGhan等[10]也發(fā)現AR陽性的TNBC與高病理學分級和淋巴結轉移有關。在本研究中Luminal A型中的表達率最高達79.55%，而在Basical-like型中表達并不高，表明AR的高表達可能與ER和PR的高表達具有相關性。Millis等[11]評估了6 341例乳腺癌患者，結果顯示TNBC中AR表達越高，ki-67水平越低，提示雄激素可能具有抗增殖作用。而本研究病例數有限，暫不能準確說明AR與ki-67表達的相關性。

本研究表明EGFR、p53、ki-67及AR的表達對乳腺癌患者的累計生存率并無統計學意義，可能是由于隨訪時間不夠長，因為有研究表明EGFR和ki-67在單因素分析中對乳腺癌患者5 a無病生存率具有預測意義，而AR和p53沒有[9]。有報道稱ki-67表達與激素受體陰性的乳腺癌患者生存率無相關性，但對激素受體陽性的乳腺癌患者預后具有預測價值[12]。也有研究顯示在TNBC中，p53基因突變率越高，患者的預后越差[13-14]。

總之，針對乳腺癌患者不單需要檢測ER、PR和Her-2的表達狀態(tài)，更應聯合檢測 EGFR、p53、ki-67和AR等分子標志物，這樣有助于綜合評價乳腺癌的發(fā)生發(fā)展進程，有效評估臨床預后，為臨床提供更佳治療方案，也有助于患者的個體化治療而實現精準醫(yī)療。