蘇龍俊，羅冬平，丁雅芳，林榮霄，伍家發(fā)，徐正順

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,我國(guó)乳腺癌發(fā)病率有逐年增高趨勢(shì),已位于女性癌癥第二位，死亡率則平均每年上升6.9%，且發(fā)病年齡早于西方國(guó)家10～15 a，呈年輕化趨勢(shì)[1]。研究表明乳腺癌發(fā)病與膳食密切相關(guān)，特別是飲食習(xí)慣[2-3]，如膳食中抗氧化成分可能調(diào)節(jié)體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)[4]。有研究發(fā)現(xiàn)膳食中抗氧化成分較多的人群患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)較低[5]。

芝麻酚(3,4-亞甲二氧基苯酚，sesamol)是芝麻油主要的香氣成分和品質(zhì)穩(wěn)定劑，具有很強(qiáng)的抑菌和抗氧化活性，是優(yōu)良的無(wú)毒抗氧化劑[6-7]。芝麻酚可作為代謝調(diào)節(jié)劑，抑制動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，降低血漿膽固醇和三酰甘油水平[8-9]，具有抗誘變[10]、抗損傷、抗衰老[11]和化學(xué)預(yù)防的作用[12]。最近，已經(jīng)闡明了芝麻的多種生物學(xué)功能，例如抑制炎癥和抗癌作用，芝麻酚在小鼠腸癌細(xì)胞中通過(guò)抑制COX-2轉(zhuǎn)錄抵抗炎癥[13]，芝麻酚可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞(HepG2)[14]、結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT116)[15]、乳腺癌細(xì)胞(MCF-7、T47D)凋亡[16]。

芝麻酚影響乳腺癌細(xì)胞增殖的研究雖有少量報(bào)道，但其作用的分子機(jī)理尚不清楚。本文試圖闡明芝麻酚抑制乳腺癌增殖的分子機(jī)理，為后續(xù)的進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料人乳腺癌MCF-7細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；芝麻酚(CAS：533-31-3，BC grade)購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，用DMSO配制；碘化丙啶、CCK8試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；RT-PCR所用試劑購(gòu)自江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)利用RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)培養(yǎng)乳腺癌MCF-7細(xì)胞， 37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%。

1.3 細(xì)胞毒性檢測(cè)采用CCK8比色法檢測(cè)細(xì)胞毒性。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)周期的MCF-7細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，每孔100 μL(5 000個(gè)細(xì)胞)接種于96孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)組：添加不同濃度(0、20、50、100和200 μmol·L-1)芝麻酚，對(duì)照組：添加DMSO。培養(yǎng)48 h，換液后加入CKK8溶液10 μL，孵育1 h，以不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液和CCK8為空白對(duì)照，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm的吸光度(OD450 nm)。使用GraphPad Prism 5 計(jì)算IC50。

1.4 細(xì)胞增殖采用CCK8比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)周期的MCF-7細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，每孔100 μL(2 000個(gè)細(xì)胞)接種于96孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)組：添加不同濃度芝麻酚(0、20、50、100和250 μmol·L-1)，對(duì)照組：添加DMSO。分別于第1、2、3、4和5 d，換液后加入CKK8溶液10 μL，孵育1 h，以不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液和CCK8為空白對(duì)照，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm的吸光度(OD450 nm)。以吸收值為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，并用SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 細(xì)胞周期檢測(cè)采用PI單染色法檢測(cè)細(xì)胞周期。按照上述方法進(jìn)行MCF-7細(xì)胞接種，給予芝麻酚(50 μmol·L-1)處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，制成單細(xì)胞懸液，離心洗滌后加入PI(50 μg·L-1)溶液和 RNaseA(20 μL·mL-1)，用200目尼龍膜過(guò)濾樣品，選488 nm波長(zhǎng)在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)并進(jìn)行細(xì)胞周期的分析。

1.6 RT-qPCR檢測(cè)利用Trizol試劑盒提取RNA，然后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用SYBR-Green試劑進(jìn)行qPCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)。qPCR引物：p53上游：5’-ATTTGCGTGTGGAGTATTTGGATG-3’，p53下游：5’-CGCCCATGCAGGAACTGTTAC-3’；p21上游：5’-ATGGAACTTCGACTTTGTCACCG-3’，p21下游：5’-CCTGCCTCCTCCCAACTCATC-3’；GAPDH上游：5’-TGGCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，GAPDH下游：5’-TGGTGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所得數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芝麻酚對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的IC50采用不同濃度(0、20、50、100和200 μmol·L-1)芝麻酚處理MCF-7細(xì)胞，然后采用CCK8比色法檢測(cè)細(xì)胞毒性。經(jīng)GraphPad Prism 5 計(jì)算IC50為48.91 μmol·L-1。

2.2 芝麻酚對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響采用不同濃度的芝麻酚處理MCF-7細(xì)胞，然后通過(guò)CCK8試劑盒檢測(cè)增殖程度。圖1所示除20 μmol·L-1濃度之外，50、100和250 μmol·L-1的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，抑制程度均具有顯著差異(P<0.05)。

2.3 芝麻酚對(duì)細(xì)胞周期的影響采用50 μmol·L-1芝麻酚處理細(xì)胞，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況，如圖2所示，與對(duì)照組相比，芝麻酚處理組的S期細(xì)胞比例顯著減少(由32.00%降到18.30%)，G0/G1期細(xì)胞顯著增加(由34.10%升到50.90%)，結(jié)果表明發(fā)生G1/S期阻滯。

2.4 芝麻酚對(duì)增殖相關(guān)基因表達(dá)的影響用50 μmol·L-1芝麻酚處理細(xì)胞48 h，然后利用RT-qPCR對(duì)G1/S期轉(zhuǎn)換的調(diào)控基因(p53、p21)進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)芝麻酚處理后，p53和p21的表達(dá)水平分別上調(diào)3.37和2.21倍(P<0.05)。見(jiàn)圖3-4。

圖1 芝麻酚對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響

圖2 芝麻酚對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞周期的影響

圖3 芝麻酚對(duì)p53表達(dá)的影響

圖4 芝麻酚對(duì)p21表達(dá)的影響

3 討論

芝麻酚可以誘導(dǎo)多種腫瘤發(fā)生凋亡，如可以通過(guò)線粒體等信號(hào)途徑誘導(dǎo)結(jié)腸癌[15]、皮膚癌[17]、肝癌[14,18]和肺癌[19]細(xì)胞發(fā)生凋亡。從圖2可以看出，在芝麻酚的作用下，亞二倍體細(xì)胞數(shù)量顯著增加，表明芝麻酚能夠誘導(dǎo)MCF-7發(fā)生凋亡，但是其分子機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

芝麻酚還可以抑制乳腺癌[16]細(xì)胞的增殖，但其作用的分子機(jī)理尚不清楚。p53基因是重要的腫瘤抑制基因，在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用，DNA損傷導(dǎo)致p53表達(dá)水平上升；p53誘導(dǎo)p21的表達(dá)，p21基因是Cip家族中的一員，主要對(duì)G1期CDKs起抑制作用，從而引發(fā)G1/S期阻滯，p53和p21共同構(gòu)成細(xì)胞周期G1期檢驗(yàn)點(diǎn)。p53同時(shí)激活DNA修復(fù)，如修復(fù)失敗，p53引發(fā)細(xì)胞凋亡[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，芝麻酚可以引發(fā)G1/S期阻滯，芝麻酚能夠顯著上調(diào)p53和p21表達(dá)，芝麻酚對(duì)G1/S期調(diào)控基因MYC和CCND1表達(dá)沒(méi)有顯著影響(結(jié)果未顯示)。研究發(fā)現(xiàn)，芝麻酚的抗腫瘤活性可能與DNA的相互作用有關(guān)，芝麻酚能夠與DNA的小溝相互作用并能夠在細(xì)胞核中累積[14]。因此作者推測(cè)芝麻酚可能干擾DNA的復(fù)制和/或修復(fù)過(guò)程，進(jìn)而激活G1期檢驗(yàn)點(diǎn)，然后p53和p21表達(dá)水平上升，導(dǎo)致G1/S阻滯。

此外，芝麻酚的抗腫瘤活性可能與其強(qiáng)大的自由基清除能力有關(guān)[10-11]?；钚匝?ROS)與腫瘤發(fā)生的關(guān)系目前仍存在爭(zhēng)議，部分學(xué)者認(rèn)為腫瘤細(xì)胞高水平活性氧啟動(dòng)分裂增殖、存活和代謝適應(yīng)信號(hào)[22]，如用抗氧化藥物(如NAC或NADPH氧化酶抑制劑)減少細(xì)胞內(nèi)活性氧水平可以抑制Kras誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的促有絲分裂信號(hào)[23]。另一方面腫瘤細(xì)胞通過(guò)提高抗氧化能力，避免因嚴(yán)重氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞死亡[24-25]。

除上述抗腫瘤活性外，芝麻酚還參與脂肪和糖代謝的調(diào)控過(guò)程[26-27]，通過(guò)調(diào)節(jié)ERK、PI3K/AKT和JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)抑制黑色素合成和酪氨酸酶表達(dá)[28]，芝麻酚具有抵抗炎癥的功效，在壞死性結(jié)腸炎中具有防護(hù)的作用[29]。 以上顯示，芝麻酚具有潛在的藥物開(kāi)發(fā)價(jià)值。