黃秋婷，王 浩，黃惠華

（1.廣州市食品檢驗(yàn)所（廣州市酒類檢測(cè)中心），廣東廣州511400；2.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州 510641）

氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，EC）是食品在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的物質(zhì)，在20世紀(jì)40年代，EC被發(fā)現(xiàn)具有致癌性，引起了各國(guó)對(duì)發(fā)酵食品中EC含量的重視[1]。酒中的EC主要是在發(fā)酵過(guò)程中，精氨酸的代謝物（尿素、瓜氨酸等氨基甲酰類化合物）與乙醇反應(yīng)產(chǎn)生[2]?？紤]到酒類食品是人類攝入EC的主要來(lái)源，部分國(guó)家對(duì)酒類食品中的EC含量進(jìn)行了限定，如加拿大、法國(guó)、捷克規(guī)定蒸餾酒中EC的限量為150 μg/L，德國(guó)、瑞士對(duì)白蘭地中EC的限量分別為800 μg/L和1000 μg/L。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)酒中EC的檢測(cè)主要采取氣相色譜-質(zhì)譜法。對(duì)于成分復(fù)雜、EC含量低的酒類樣品，需要采取不同的萃取和濃縮方式，以減少干擾，提高方法靈敏度[3-7]。此類分析方法準(zhǔn)確度高，但存在設(shè)備昂貴、前處理復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、對(duì)人員要求高、檢測(cè)成本高等缺點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用薄層層析的方法，樣品無(wú)需經(jīng)過(guò)前處理，直接點(diǎn)樣，結(jié)合數(shù)碼成像技術(shù)，使用MATLAB軟件[8]對(duì)斑點(diǎn)的灰度值進(jìn)行定量計(jì)算，以達(dá)到快速測(cè)定、降低檢測(cè)成本、簡(jiǎn)化分析流程的目的。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：40%vol白酒，購(gòu)自超市。

試劑及耗材：氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)樣，純度99%，購(gòu)自阿拉丁公司，實(shí)驗(yàn)時(shí)用40%無(wú)水乙醇（體積比）作溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)液；肉桂醛，色譜級(jí)，購(gòu)自阿拉丁公司；其余試劑如磷酸、丙酮、甲基叔丁基醚、正己烷、甲醇、無(wú)水乙醇等，均為分析純。

儀器設(shè)備：實(shí)驗(yàn)室自制浸板機(jī)；MATLAB軟件；ZF-90D暗箱式紫外分析儀，上海光豪分析儀器有限公司；尼康L330數(shù)碼相機(jī)；100×100 mm雙槽展開(kāi)缸；50×100 mm GF254薄層硅膠板，青島譜科分離材料有限公司；10 μL微量進(jìn)樣針，上海安亭微量進(jìn)樣器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 展開(kāi)條件

薄板層析展開(kāi)劑的配制：甲基叔丁基醚∶正己烷∶甲醇（5∶7∶2），充分混合均勻后倒入展開(kāi)缸的一側(cè)。在有展開(kāi)劑的一側(cè)放入薄層板，當(dāng)展開(kāi)劑前沿到達(dá)標(biāo)線后取出薄層板，在通風(fēng)柜中晾干。

1.2.2 薄層數(shù)碼成像系統(tǒng)組裝及使用參數(shù)

將尼康L330數(shù)碼相機(jī)安裝在ZF-90D暗箱式紫外分析儀的固定支架上，構(gòu)成一套用于獲取數(shù)字圖像的裝置，紫外燈波長(zhǎng)為365 nm，數(shù)碼相機(jī)拍攝參數(shù)設(shè)置：尺寸2272×1704，曝光時(shí)間1 s，ISO速度ISO-200，焦距9毫米，最大光圈3.3，35 mm焦距52，場(chǎng)景為自動(dòng)模式，白平衡為熒光燈，色彩選項(xiàng)為標(biāo)準(zhǔn)色彩。

1.2.3 薄層顯色實(shí)驗(yàn)步驟

將新購(gòu)置的薄層板在烘箱中105℃活化30 min后放于干燥器中冷卻備用。在距薄層板端部10 mm，距側(cè)面10 mm處點(diǎn)樣，在距另一端20 mm處劃線，作為展開(kāi)結(jié)束的標(biāo)線。點(diǎn)樣結(jié)束后按照1.2展開(kāi)條件操作。使用實(shí)驗(yàn)室自制浸板機(jī)，使薄層板與衍生液接觸。將完成浸板操作的薄層板置于溫度已達(dá)到125℃的烘箱中反應(yīng)，10 min后取出薄層板。待薄層板冷卻后進(jìn)行拍照，使用MATLAB軟件對(duì)獲取的數(shù)字圖像上的EC熒光斑點(diǎn)積分定量。

1.2.4 MATLAB積分定量操作步驟

打開(kāi)MATLAB，使用imread命令讀取拍攝好的數(shù)字圖像；將數(shù)字圖像的紅色通道和藍(lán)色通道矩陣設(shè)置為零矩陣；使用imcrop命令截取有斑點(diǎn)部分的數(shù)字圖像，圖像像素大小為400×200；使用rgb2gray命令將截圖的綠色通道圖像轉(zhuǎn)化為灰度圖；使用wiener2命令去除灰度圖上的噪聲；使用imadjust命令，將圖像中1%的數(shù)據(jù)飽和至最低和最高亮度，保存變換后的圖像；使用im2bw命令，調(diào)整閾值，使得獲得的二值圖像的斑點(diǎn)輪廓足夠接近上一步變換后圖像的最高亮度區(qū)域，保存調(diào)整好的二值圖；將二值圖與去噪后的灰度圖矩陣點(diǎn)乘，得到需要定量的斑點(diǎn)；使用fliplr命令獲得去噪灰度圖的鏡面圖像，將該圖像與二值圖矩陣點(diǎn)乘，得到同樣斑點(diǎn)大小的背景圖像；將斑點(diǎn)灰度值積分減去背景灰度值積分之后除以斑點(diǎn)像素個(gè)數(shù)，得到平均灰度值（平均GL），該值作為后續(xù)的定量指標(biāo)。

1.2.5 衍生顯色單因素實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)中使用的EC濃度為10 mg/L，點(diǎn)樣量為10 μL，即在斑點(diǎn)上的EC點(diǎn)樣量為100 ng/點(diǎn)。衍生液溶劑丙酮定為40 mL，肉桂醛250 μL，磷酸2.4 mL。實(shí)驗(yàn)室自制浸板機(jī)的浸漬時(shí)間默認(rèn)為3000 ms。

1.2.5.1 肉桂醛含量的優(yōu)化

分別向肉桂醛含量為50 μL、100 μL、150 μL、200 μL、250 μL、300 μL、350 μL、400 μL、450 μL、500 μL的10組燒杯中加入40 mL丙酮和2.4 mL磷酸，充分混合均勻后備用。按照步驟1.2.4操作，每個(gè)含量做3個(gè)平行樣，比較平均灰度值。

1.2.5.2 磷酸含量的優(yōu)化

分別向含有肉桂醛250 μL的丙酮溶液中加入1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL磷酸，充分混合均勻后備用。按照步驟1.2.3操作，每個(gè)含量做3個(gè)平行樣，比較平均灰度值。

1.2.5.3 浸板時(shí)間的優(yōu)化

配制的肉桂醛衍生液，更改實(shí)驗(yàn)室自制浸板機(jī)的浸漬時(shí)間分別為 1000 ms、2000 ms、3000 ms、4000 ms、5000 ms。按照步驟1.2.3操作，每個(gè)含量做3個(gè)平行樣，比較平均灰度值。

1.2.5.4 反應(yīng)溫度的優(yōu)化

配制肉桂醛衍生液，更改烘箱溫度分別為90℃、100℃、110℃、120℃、130℃。按照步驟1.2.3操作，每個(gè)含量做3個(gè)平行樣，比較平均灰度值。

1.2.5.5 反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)的優(yōu)化

配制肉桂醛衍生液，更改薄層板加熱時(shí)間分別為 4 min、6 min、8 min、10 min、12 min。按照步驟1.2.3操作，每個(gè)含量做3個(gè)平行樣，比較平均灰度值。

1.2.6 方法學(xué)考察

根據(jù)單因素得出的最優(yōu)反應(yīng)及操作條件，進(jìn)行方法學(xué)上的考察。

1.2.7 精密度

使用5 mg/L的EC標(biāo)準(zhǔn)液，在5塊5×10 cm薄層硅膠板點(diǎn)樣，點(diǎn)樣量都為10 ng/點(diǎn)。按照上述實(shí)驗(yàn)步驟和最優(yōu)的操作條件，得到斑點(diǎn)平均灰度值。

1.2.8 斑點(diǎn)穩(wěn)定性

在1塊5×10 cm薄層硅膠板上點(diǎn)樣，點(diǎn)樣量為50 ng/點(diǎn)。按照上述實(shí)驗(yàn)步驟和最優(yōu)的操作條件，以薄層板從烘箱拿出立即拍照為0 min，每隔1 min拍照1次，計(jì)算斑點(diǎn)的平均灰度值。

1.2.9 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

使用10 mg/L的EC標(biāo)準(zhǔn)液，在薄層板上點(diǎn)樣，分別為 8 ng/點(diǎn)、10 ng/點(diǎn) ng/點(diǎn)、12 ng/點(diǎn)、14 ng/點(diǎn)、16 ng/點(diǎn)、18 ng/點(diǎn)。按照上述實(shí)驗(yàn)步驟和最優(yōu)的操作條件，得到斑點(diǎn)平均灰度值。

1.2.10 加標(biāo)回收率

在4塊5×10 cm薄層硅膠板點(diǎn)樣，點(diǎn)樣量分別為10 μL酒樣、10 μL酒樣+4 ng EC標(biāo)品、10 μL酒樣+6 ng EC標(biāo)品、10 μL酒樣+10 ng EC標(biāo)品。按照上述實(shí)驗(yàn)步驟和最優(yōu)的操作條件，得到斑點(diǎn)的平均灰度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算EC含量的加標(biāo)回收率。

1.2.11 檢出限的確定

對(duì)10 mg/L EC標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行6次測(cè)定，在5×10 cm薄層硅膠板上的點(diǎn)樣量都為8 ng/點(diǎn)，獲得測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差S，查出相應(yīng)的t，檢出標(biāo)準(zhǔn)=t空白S空白，按公式（檢出限=檢出標(biāo)準(zhǔn)+St）計(jì)算檢出限。

1.2.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，取平均值并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生顯色單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 肉桂醛含量的影響（圖1）

圖1 肉桂醛含量對(duì)灰度值的影響（n=3）

當(dāng)衍生液中的肉桂醛含量為250 μL時(shí)，斑點(diǎn)的平均灰度值為最大，而隨著肉桂醛含量的增加，背景平均灰度值始終增加。當(dāng)肉桂醛含量增加超過(guò)250 μL后，背景灰度值繼續(xù)增加，而此時(shí)斑點(diǎn)衍生反應(yīng)已充分，亮度不再增大，且有可能影響斑點(diǎn)熒光產(chǎn)生，最終得到的平均灰度值下降，因此肉桂醛的最優(yōu)使用量為250 μL。

2.1.2 磷酸含量的影響（圖2）

當(dāng)衍生液中的磷酸含量為3 mL時(shí)，斑點(diǎn)的平均灰度值為最大，而隨著磷酸含量的增加，背景平均灰度值增加且趨于穩(wěn)定。當(dāng)磷酸含量超過(guò)3 mL后，可能多余磷酸的存在對(duì)熒光斑點(diǎn)亮度產(chǎn)生了抑制，最終得到的平均灰度值下降，因此磷酸的最優(yōu)使用量為3 mL。

2.1.3 浸板時(shí)間的影響（圖3）

圖2 磷酸含量對(duì)灰度值的影響（n=3）

圖3 浸板時(shí)間對(duì)灰度值的影響（n=3）

當(dāng)接觸時(shí)間在3～4 s，斑點(diǎn)的平均灰度值為最大。隨著接觸時(shí)長(zhǎng)的延長(zhǎng)，背景平均灰度值增加，但當(dāng)超過(guò)4 s后，灰度值下降。從3 s到4 s，背景的灰度值增加，而斑點(diǎn)的平均灰度值基本不變，說(shuō)明在1 s內(nèi)，增加了衍生液與薄層板接觸的機(jī)會(huì)，但4 s后，背景平均灰度值下降，可能是過(guò)長(zhǎng)的接觸時(shí)間，使得薄層板的硅膠成分脫落，為了使衍生液充分接觸薄層板且不使硅膠脫落，因此選擇浸板操作的時(shí)間為4 s。

2.1.4 反應(yīng)溫度的影響（圖4）

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)灰度值的影響（n=3）

當(dāng)反應(yīng)溫度在120℃時(shí)，斑點(diǎn)的平均灰度值為最大，反應(yīng)溫度的提升超過(guò)120℃后，背景平均灰度值繼續(xù)增加，而斑點(diǎn)的平均灰度值下降，因此最優(yōu)的反應(yīng)溫度是120℃。

2.1.5 反應(yīng)時(shí)間的影響（圖5）

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)灰度值的影響（n=3）

當(dāng)反應(yīng)時(shí)間在12 min時(shí)，斑點(diǎn)的平均灰度值為最大，繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間對(duì)背景亮度產(chǎn)生有反作用，在實(shí)測(cè)中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)14 min加熱后，365 nm下薄層硅膠板整體紅色最為明顯，可能是過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的加熱使硅膠板表面氧化加劇，因此，選擇最優(yōu)的反應(yīng)時(shí)間為12 min。

2.2 方法學(xué)考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 精密度和斑點(diǎn)穩(wěn)定性（圖6、圖7）

圖6 精密度結(jié)果（n=5）

圖7 斑點(diǎn)穩(wěn)定性結(jié)果

圖6為10 ng/點(diǎn)樣品在5塊不同的5×10 cm薄層硅膠板按相同最佳操作得到的結(jié)果，其中平均GL的RSD為9.70%（n=5），平均背景GL的RSD為2.42%（n=5）。可見(jiàn)方法在不同薄層硅膠板上的重復(fù)性較好，造成點(diǎn)樣量相同但結(jié)果不同的原因可能是在點(diǎn)樣時(shí)，由于人工的操作失誤，斑點(diǎn)點(diǎn)樣不是非常均勻，也可能是購(gòu)買的薄層板不是每一塊都均勻等因素導(dǎo)致。

圖7為50 ng/點(diǎn)的樣品每隔1 min拍照分析得到的斑點(diǎn)灰度值，可見(jiàn)在2 min后50 ng含量的EC斑點(diǎn)的平均GL趨于穩(wěn)定，灰度值為18。

2.2.2 相關(guān)性、加標(biāo)回收率和檢出限的確定

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，在薄層板上點(diǎn)不同含量的EC，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果作圖，獲得相應(yīng)的工作曲線，方法的線性擬合方程為y=0.742x-3.3248，相關(guān)系數(shù)R2=0.992。

加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)行分別加入0、4 ng、6 ng、10 ng的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)測(cè)得的平均GL值分別為2.4877、5.0015、5.7005、6.9492。4 ng、6 ng、10 ng的加標(biāo)回收率分別為84.70%、72.17%、60.12%。

由于本方法是通過(guò)肉眼確定斑點(diǎn)是否存在，再用軟件積分計(jì)算，當(dāng)不可見(jiàn)斑點(diǎn)時(shí)，空白SD值即為0，則檢出限為0.595 mg/L。檢出限的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 DE-TLC方法測(cè)定氨基甲酸乙酯的檢出限

3 結(jié)論

使用薄層數(shù)碼成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)氨基甲酸乙酯定量分析，通過(guò)研究衍生顯色中的單因素，確定了方法的最優(yōu)衍生條件，40 mL丙酮中，肉桂醛含量250 μL、磷酸含量3 mL、浸板時(shí)間4 s、加熱溫度120℃，加熱時(shí)間12 min。采用最優(yōu)條件對(duì)薄層成像法定量EC進(jìn)行了方法學(xué)上的考察，不同薄層板上斑點(diǎn)的RSD=9.70%（n=5,10 ng）；烤板結(jié)束2 min后，斑點(diǎn)的平均灰度值趨于穩(wěn)定；當(dāng)EC含量在8～18 ng/點(diǎn)的范圍內(nèi)，其含量與平均GL呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.992，檢出限為0.595 mg/L，樣品加標(biāo)回收率在60.12%～84.70%。