曹津津 孫啟瑞 李文紅 宋冉冉 曹倩玉 王可 魏永巨

摘?要?研究了木蘭花堿（Magnoflorine，MAG）的熒光光譜和吸收光譜特征，考察了pH值等環(huán)境因素對(duì)熒光和吸光的影響，探討了光譜性質(zhì)與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系。木蘭花堿水溶液的三維熒光圖譜中呈現(xiàn)3個(gè)熒光峰，激發(fā)波長(zhǎng)λex為230、275和315 nm，發(fā)射波長(zhǎng)λem均為420 nm。隨溶液pH值升高，激發(fā)光譜中的熒光峰紅移并出現(xiàn)等熒光點(diǎn)，吸收光譜中的吸收峰紅移并形成等色點(diǎn)，表明木蘭花堿分子中的1個(gè)羥基發(fā)生了質(zhì)子電離，用pH值-吸光法測(cè)得電離常數(shù)pKa=4.77。以L-色氨酸為參比，測(cè)得木蘭花堿水溶液的熒光量子產(chǎn)率Y=0.19。青風(fēng)藤等多種中藥材的三維熒光圖譜中呈現(xiàn)木蘭花堿的特征熒光峰，λex/λem=315 nm/420 nm處的熒光峰不受共存組分的影響，且熒光強(qiáng)度穩(wěn)定，據(jù)此建立了中藥青風(fēng)藤中木蘭花堿的熒光分析新方法。在0.04～1.25 μg/mL范圍內(nèi)，體系熒光強(qiáng)度IF與木蘭花堿濃度c呈線性關(guān)系，回歸方程為：IF=6146.8c+ 24.4（R=0.999， n=11），檢出限0.52 ng/mL。采用本方法測(cè)得青風(fēng)藤對(duì)照藥材中MAG的含量為0.63%，加標(biāo)回收率為101.2%～102.7%。LC-MS/MS法測(cè)定結(jié)果為0.61%，與熒光法基本一致。本方法簡(jiǎn)便快速，結(jié)果可靠，有良好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞?木蘭花堿; 青風(fēng)藤; ?中藥; ?三維熒光; ?熒光分析

1?引 言

木蘭花堿（又稱木蘭堿，Magnoflorine，MAG，圖1）屬于阿樸菲類生物堿（Aporphine alkaloids）[1]，廣泛存在于防己科、馬兜鈴科等藥用植物中[2～4]，具有抗氧化[3，5]、膜保護(hù)[6]、降血糖[7]和抗遺忘[8]等藥理作用，但目前木蘭花堿尚未被收錄入中國(guó)藥典或作為藥品標(biāo)準(zhǔn)。關(guān)于藥用植物和生物樣品中木蘭花堿的分析方法，主要包括色譜法[9，10]、毛細(xì)管電泳法[11，12]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法[13]，迄今尚未見關(guān)于木蘭花堿熒光性質(zhì)及熒光分析方法的研究報(bào)道。

熒光分析法具有靈敏度高、選擇性好、簡(jiǎn)便快速、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，在生化分析和化學(xué)藥物分析中應(yīng)用廣泛。但在中藥分析中，由于樣品所含成分的復(fù)雜性以及中藥成分熒光光譜數(shù)據(jù)的缺乏，熒光分析法的應(yīng)用尚不廣泛[14]。目前，中國(guó)藥典中收錄的中藥分析方法主要是色譜等方法，熒光法未被用于中藥成分的定量分析。用熒光法測(cè)定中藥成分的含量，難點(diǎn)在于如何避免共存組分的干擾。文獻(xiàn)報(bào)道的中藥熒光分析方法可大致分為兩類：一是常規(guī)的熒光分析法，基于被測(cè)組分與共存組分在熒光波長(zhǎng)和強(qiáng)度上的差異，實(shí)現(xiàn)快速分析[15，16]; 二是采用三維熒光法結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法[17，18]，利用三維熒光光譜信息，借助數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)分離程序，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣品中熒光性質(zhì)相近的藥效成分的計(jì)算分析[19，20]。常規(guī)方法簡(jiǎn)便快速，便于應(yīng)用; 三維熒光結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法可以解決某些常規(guī)方法難以解決的問(wèn)題，擴(kuò)展了熒光法的應(yīng)用范圍。中藥成分種類繁多、數(shù)量龐大，開展中藥成分熒光性質(zhì)的研究是發(fā)展中藥熒光分析法的關(guān)鍵。

本研究組在研究生物堿類化合物的熒光性質(zhì)時(shí)，發(fā)現(xiàn)木蘭花堿有強(qiáng)熒光，其三維熒光圖譜有很好的特征性。將木蘭花堿標(biāo)準(zhǔn)品的三維熒光圖譜與本實(shí)驗(yàn)室前期得到的數(shù)百種中藥對(duì)照藥材的三維熒光圖譜進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)青風(fēng)藤等多種中藥材的三維熒光圖譜中呈現(xiàn)木蘭花堿的特征熒光峰，由此推測(cè)這些中藥材中可能含有木蘭花堿，因此，可望將木蘭花堿的熒光性質(zhì)用于中藥分析。本研究對(duì)木蘭花堿和青風(fēng)藤的熒光性質(zhì)進(jìn)行了詳細(xì)考察，建立了青風(fēng)藤中木蘭花堿的熒光分析方法，并利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）對(duì)本方法進(jìn)行了驗(yàn)證。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

F-7000熒光分光光度計(jì)（日本Hitachi公司）; UV-2501PC紫外-可見分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）; LC-TRIPLE QUAD 5500液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)AB SCIEX公司）; Milli-Q型超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）; 828型pH/ISE測(cè)試儀（芬蘭Orion公司）; 十萬(wàn)分之一分析天平（日本Shimadzu公司）。

木蘭花堿（CAS： 2141-9-5，HPLC級(jí)，純度>98%，成都瑞芬思生物科技有限公司）溶液：稱取木蘭花堿對(duì)照品2.08 mg，用水溶解并定容至25 mL，配制成83.2 μg/mL木蘭花堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，低溫保存，備用，使用時(shí)適當(dāng)稀釋; 青風(fēng)藤對(duì)照藥材（1251-0301，防己科植物青藤 Sinomenium acutum （ Thunb.） Rehd. et Wils.（Qingfengteng）的干燥藤莖，中國(guó)食品藥品檢定研究院）; 甲醇（色譜純，美國(guó)Tedia公司），經(jīng)檢驗(yàn)無(wú)熒光; 甲酸（色譜純，美國(guó)Dikma公司）; 緩沖溶液：將含磷酸、乙酸和硼酸的混合溶液（均為0.20 mol/L）與NaOH溶液（1.0 mol/L）以一定比例混合，用于調(diào)節(jié)pH值; L-色氨酸（L-Tryptophan，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）; 實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水，經(jīng)檢測(cè)無(wú)熒光。

2.2?實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1?pH值對(duì)吸光和熒光的影響?在一系列10 mL容量瓶中，分別加入適量木蘭花堿溶液，以緩沖溶液控制pH值，以水定容，分別掃描各溶液的吸收光譜或熒光光譜，并精確測(cè)量pH值，熒光測(cè)定時(shí)選擇激發(fā)和發(fā)射狹縫（Slit）為5.0 nm，光電倍增管負(fù)高壓（PMT）為700 V。

2.2.2?熒光量子產(chǎn)率的測(cè)量?在25 mL容量瓶中分別加入適量L-色氨酸溶液和木蘭花堿溶液（控制溶液濃度，使激發(fā)波長(zhǎng)下的吸光度A≤0.05），以水定容。測(cè)量吸收光譜和熒光光譜，測(cè)量激發(fā)波長(zhǎng)處的吸光度和積分熒光強(qiáng)度。以L-色氨酸為參比（280 nm處的熒光量子產(chǎn)率0.14），計(jì)算待測(cè)物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率[21]。

2.2.3?青風(fēng)藤樣品提取液的制備?經(jīng)不同比例的甲醇-水提取溶劑的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，確定提取溶劑中甲醇的體積分?jǐn)?shù)為60%。稱取青風(fēng)藤對(duì)照藥材粉末0.025 g，以提取溶劑溶解并定容至50 mL，超聲振蕩30 min，靜置過(guò)夜，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，得濃度為500 μg/mL的提取液。

2.2.4?色譜條件?Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（50 mm × 4.6 mm， 1.8 μm）; ?流動(dòng)相： 甲醇-?0.01%甲酸（60∶40， V/V）; ?流速0.3 mL/min; 柱溫40℃; ?進(jìn)樣量4 μL。

2.2.5?質(zhì)譜條件?離子源為電噴霧電離源 （ESI）; 氣簾氣（CUR）： 275 kPa; 離子化電壓5.5 kV; 離子源溫度500℃; 噴霧氣（GAS1）： 345 kPa; 輔助加熱氣（GAS2）： 345 kPa; 正離子全掃描方式; 采用多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式定量分析。木蘭花堿的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見表1，與文獻(xiàn)[22]中的參數(shù)基本一致。

3?結(jié)果與討論

3.1?木蘭花堿水溶液的三維熒光圖譜

在酸性條件下，木蘭花堿水溶液在發(fā)射波長(zhǎng)（λem）420 nm處呈現(xiàn)一組熒光峰，激發(fā)波長(zhǎng)（λex）分別為230、 270和300 nm（圖2A）; pH值為近中性時(shí)（圖2B），λem基本不變，λex和熒光峰形有所變化，圖2A中300 nm激發(fā)峰紅移至315 nm; pH值升高至堿性時(shí)（圖2C），熒光波長(zhǎng)基本不變。上述結(jié)果表明，在溶液pH值由酸性到近中性的過(guò)程中，木蘭花堿的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，其分子中的羥基可能發(fā)生了質(zhì)子電離[23]。

木蘭花堿三維熒光圖譜（圖2）有較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度和很好的特征性。本實(shí)驗(yàn)室曾研究過(guò)數(shù)百種中藥材的三維熒光圖譜[24]，因缺乏中藥成分熒光性質(zhì)基礎(chǔ)資料，其中大多數(shù)難以判斷熒光峰的歸屬。將圖2與這些中藥材的三維熒光圖譜進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)青風(fēng)藤、川烏、黃連、威靈仙、關(guān)黃柏、酸棗仁、淫羊藿等中藥材的三維熒光圖譜中呈現(xiàn)木蘭花堿的熒光峰。因此，木蘭花堿的熒光性質(zhì)可望用于這些中藥材的鑒別與其中木蘭花堿的測(cè)定。

3.2?木蘭花堿熒光的影響因素

測(cè)定了木蘭花堿在不同pH值條件下的二維熒光光譜（圖3A）。在酸性條件下（pH 1.7～5.9），隨pH值升高，激發(fā)光譜中270 nm處的熒光峰減弱并紅移至275 nm，230 和300 nm處的熒光峰升高并分別紅移至235和315 nm，在252和297 nm出現(xiàn)等熒光點(diǎn); 發(fā)射光譜中420 nm處的熒光峰波長(zhǎng)不變，但強(qiáng)度減弱。在近中性及堿性條件下（pH 6.4～14.0），熒光波長(zhǎng)和強(qiáng)度均基本不變。熒光強(qiáng)度與pH值之間的關(guān)系如圖3B所示。

根據(jù)不同pH值下木蘭花堿的熒光光譜變化推斷，在pH 1.7～14.0之間，木蘭花堿發(fā)生了羥基質(zhì)子電離。激發(fā)光譜中等熒光點(diǎn)的出現(xiàn)表明，在pH值變化過(guò)程中，木蘭花堿存在兩種熒光型體的轉(zhuǎn)化[23]，一種是在酸性條件下的分子型體，另一種是在近中性和堿性條件下的離子型體，兩種型體的熒光激發(fā)波長(zhǎng)不同，發(fā)射波長(zhǎng)相同，均為420 nm。木蘭花堿分子結(jié)構(gòu)中有2個(gè)羥基，但只有1個(gè)羥基質(zhì)子電離。從分子結(jié)構(gòu)看，木蘭花堿B環(huán)上季銨N原子帶正電荷，對(duì)相鄰A環(huán)的π-電子體系有吸引作用，使得C1位上的羥基較易電離出質(zhì)子。文獻(xiàn)[25]計(jì)算得到C1位OH鍵能（88.7 kcal/mol）低于C11位OH鍵能（90.9 kcal/mol）。因此，推測(cè)應(yīng)該是C1位羥基質(zhì)子電離。質(zhì)子電離后產(chǎn)生的氧負(fù)離子與A環(huán)共軛，增大了A環(huán)的電子云密度，導(dǎo)致激發(fā)波長(zhǎng)（吸收波長(zhǎng)）紅移。另一方面，氧負(fù)離子可能與空間距離較近的D環(huán)C11位羥基形成分子內(nèi)氫鍵[26]，導(dǎo)致C11位羥基質(zhì)子難以電離。

甲醇和水是提取及測(cè)定中藥熒光成分時(shí)的常用溶劑。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在水-甲醇體系中，隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)增大，木蘭花堿的λem逐步藍(lán)移; 在甲醇中λem=375 nm，熒光有所增強(qiáng)。從實(shí)驗(yàn)成本和環(huán)境保護(hù)等方面考慮，應(yīng)選擇在近中性水溶液中測(cè)定木蘭花堿的熒光。

有序介質(zhì)常對(duì)物質(zhì)的熒光有敏化作用。結(jié)果表明， 0.02 mol/L 十二烷基硫酸鈉（SDS）和溴化十六烷基三甲銨（CTAB）對(duì)木蘭花堿水溶液的熒光基本無(wú)影響。因此，可直接利用木蘭花堿的內(nèi)源熒光。

在日內(nèi)和日間（1，3和5 d）分別測(cè)量9份相同濃度的木蘭花堿水溶液的熒光強(qiáng)度，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.5%和1.2%，表明木蘭花堿的熒光穩(wěn)定。

綜上，木蘭花堿在近中性水溶液中有穩(wěn)定的強(qiáng)熒光，適宜用于分析測(cè)定。

3.3?木蘭花堿的吸收光譜與電離常數(shù)

為了驗(yàn)證上述木蘭花堿熒光光譜隨pH值變化的分子機(jī)理，測(cè)定了木蘭花堿水溶液在不同pH值下的吸收光譜（理論上，熒光激發(fā)光譜與吸收光譜的圖形相似，隨pH值變化的趨勢(shì)相同），結(jié)果見圖4A。在酸性條件下，木蘭花堿在250～380 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)有2個(gè)吸收峰，吸收波長(zhǎng)分別為268和300 nm。隨pH值升高，268 nm處的吸收峰紅移至275 nm，吸光度降低; 同時(shí)，300 nm吸收峰紅移至316 nm，吸光度升高，在254 nm和302 nm形成等色點(diǎn); pH>6后，吸收光譜不再隨pH值的升高而變化。各光譜曲線在320 nm處的吸光度A與pH值的關(guān)系呈S形曲線（圖4B）。在240～350 nm范圍，圖4中的吸收光譜與圖3中的熒光激發(fā)光譜形狀相似，變化趨勢(shì)相同。

圖4A中出現(xiàn)等色點(diǎn)，表明木蘭花堿在水溶液中存在兩種吸光型體（也是熒光型體）的相互轉(zhuǎn)化，木蘭花堿發(fā)生了質(zhì)子電離，表現(xiàn)為一元弱酸。根據(jù)圖4中的光譜數(shù)據(jù)，可以用pH值-光度法測(cè)定木蘭花堿羥基質(zhì)子的電離常數(shù)pKa，計(jì)算公式為：

式中， AHL表示弱酸分子全部以分子型體存在時(shí)的吸光度（如圖4B中pH 2.5附近的A值）， AL表示弱酸分子全部以離子型體存在時(shí)的吸光度（如圖4B中pH 7.0附近的A值）。將圖4B中位于S形曲線中間部分的 pH-A數(shù)據(jù)代入式（1），計(jì)算pKa，結(jié)果見表2， 平均值為pKa=4.77。

3.4?木蘭花堿的熒光量子產(chǎn)率的測(cè)定

按照2.2.2節(jié)方法測(cè)得木蘭花堿水溶液（離子型體）的熒光量子產(chǎn)率為0.19，屬于強(qiáng)熒光物質(zhì)。從分子結(jié)構(gòu)（圖1）上看，木蘭花堿具有強(qiáng)熒光物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)特征：具有大的共軛π鍵結(jié)構(gòu)，圖1中A、D兩個(gè)苯環(huán)形成聯(lián)苯結(jié)構(gòu)，共軛程度較高; 具有剛性平面結(jié)構(gòu)，C環(huán)與A、D兩環(huán)連接，增加了分子的平面性和剛性，其離子型體的C1位氧負(fù)離子可能與C11位羥基形成分子內(nèi)氫鍵，也使分子的剛性增強(qiáng); 苯環(huán)上的給電子取代基（羥基和甲氧基）具有增強(qiáng)熒光的作用; 從圖1和熒光波長(zhǎng)為420 nm可以推斷，木蘭花堿的最低單線電子激發(fā)態(tài)S1為（π，π*）型，此類躍遷幾率高，熒光強(qiáng)度大。

3.5?中藥青風(fēng)藤提取液的三維熒光圖譜

青風(fēng)藤為防己科植物青藤和毛青藤的干燥藤莖，主治風(fēng)濕痹痛、關(guān)節(jié)腫痛等癥[27]。在青風(fēng)藤藥材中已發(fā)現(xiàn)逾60種化合物，主要包括生物堿類、脂類、甾醇類、萜類、菲類和蒽醌類等[28]，其藥效成分主要為嗎啡烷類[29，30]和阿樸菲類[31]生物堿。雖然青風(fēng)藤中的化學(xué)成分種類繁多，但其提取液的熒光光譜比較簡(jiǎn)單（圖5）。

圖5與圖2中，位于λem=420 nm的熒光峰的激發(fā)波長(zhǎng)和光譜形狀基本一致，且隨pH值的變化基本相同，可判斷為木蘭花堿的熒光峰。在圖5中，短波處（λem=330～340 nm）的熒光峰推測(cè)為嗎啡烷類生物堿，此類化合物的分子共軛程度較低，熒光波長(zhǎng)較短。在堿性條件下（圖5C），木蘭花堿熒光峰的λem略有紅移，可能是菲類及蒽醌類化合物所致，這些化合物的分子共軛程度較高，熒光波長(zhǎng)較長(zhǎng)。對(duì)比圖5和圖2可知，如選擇在中性水溶液中，激發(fā)波長(zhǎng)為315 nm時(shí)測(cè)定木蘭花堿的熒光，青風(fēng)藤中的其它組分基本不干擾。

3.6?青風(fēng)藤中木蘭花堿的熒光法測(cè)定

測(cè)定不同濃度的木蘭花堿系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光光譜（圖6），熒光強(qiáng)度IF（λex/λem=315 nm/420 nm）與木蘭花堿在0.04～1.25 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為IF=6146.8c+ 24.4，相關(guān)系數(shù)R=0.999（n=11）。以空白信號(hào)3倍的標(biāo)偏差計(jì)算方法的檢出限為0.52 ng/mL。

在青風(fēng)藤樣品提取液中加入不同體積的木蘭花堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。回收率在101.2%～102.7%之間。 配制4份不同濃度的青風(fēng)藤提取液，采用本方法測(cè)得木蘭花堿的含量平均值為0.63%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD， n=4）為0.1%。用本方法測(cè)定木蘭花堿時(shí)，如果樣品提取液中的其它組分在測(cè)量波長(zhǎng)下也產(chǎn)生熒光，則會(huì)對(duì)測(cè)定產(chǎn)生干擾。利用LC-MS/MS，測(cè)得同一青風(fēng)藤樣品中木蘭花堿的含量為0.61%，RSD為2.5%（n=3）。兩種方法測(cè)定結(jié)果基本一致。

4?結(jié) 論

木蘭花堿水溶液可產(chǎn)生穩(wěn)定的強(qiáng)熒光，可用于中藥樣品中木蘭花堿的測(cè)定。本研究建立的青風(fēng)藤中木蘭花堿的熒光分析新方法具有簡(jiǎn)便快速、環(huán)境友好、靈敏度高、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)， 研究結(jié)果為中藥和生化樣品中木蘭花堿的分析測(cè)定提供了新思路。

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