古建雄 劉彬

【摘要】 目的 探討免疫組化與原位雜交雙標記技術檢測EB病毒用于診斷鼻咽癌的效果。方法 47例鼻咽癌患者作為研究對象， 進行免疫組化和原位雜交雙標記技術檢測鼻咽癌細胞中 EB 病毒的表達情況， 觀察檢測效果。結果 免疫組化檢測結果顯示， 廣譜細胞角蛋白（CK）定位于細胞漿內。原位雜交雙標記技術檢測結果顯示， EB病毒編碼的小 RNA（EBER）陽性反應定位于鼻咽癌細胞的細胞核上。免疫組化檢測后的陽性細胞的胞膜表現(xiàn)為紅色， 原位雜交雙標記技術檢測后的陽性細胞核表現(xiàn)為藍黑色， 而雙陽性細胞的核與膜呈現(xiàn)藍紅色， 不僅對比鮮明同時背景十分清楚， 雙染成功后細胞及組織結構表現(xiàn)完整。結論 免疫組化與原位雜交雙標記技術檢測EB病毒用于診斷鼻咽癌均有一定作用， 但原位雜交雙標記技術檢測比免疫組化方法更靈敏， 值得臨床推廣應用。

【關鍵詞】 鼻咽癌;病理診斷;原位雜交雙標記技術;免疫組化

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.11.012

鼻咽癌是一種在我國南方地區(qū)發(fā)病率非常高的惡性腫瘤， 由于缺乏特異性的診斷方法， 患者往往預后較差[1]。鼻咽癌又分為角化性鱗狀細胞癌、非角化性癌以及基底樣鱗狀細胞癌， 其中未分化型的非角化性癌是最常見的。目前手術切除以及術后放化療治療對于提高患者的生存率有很好的作用， 都屬于不可缺少的治療手段[2]。鼻咽癌活檢病理診斷應用較多的指標是CK免疫組化染色， 可能對鼻咽癌的診斷具有重要意義。免疫組化檢測與原位雜交雙標記技術檢測， 可同時分析CK與EBER兩種指標在鼻咽癌細胞中的表達情況， 免疫組化這種傳統(tǒng)的檢測方法有助于鼻咽癌的病理診斷[3]。本文主要探討免疫組化與原位雜交雙標記技術檢測EB病毒用于診斷鼻咽癌的效果， 為促進鼻咽癌的診斷提供合理的參考， 現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選擇2004年1月～2018年1月來本院進行治療的47例鼻咽癌患者作為此次研究對象， 其中男27例、女20例。47例鼻咽癌患者均經病理學診斷。組織經 4%中性甲醛固定并用常規(guī)石蠟包埋， 切片厚3.5 μm左右。

1. 2 試劑及方法

1. 2. 1 試劑 EGFR基因檢測試劑盒[國食藥監(jiān)械（準）字2013第3402095號]， 包括蛋白酶K， FITC標記的EBER探針（福建泰普生物科學有限公司）， 堿性磷酸酶標記的抗異硫氰酸熒光素（FITC）抗體（重慶沒濤生物科學有限公司）， 及BCIP/NBT顯色液等（江西仙巖生物科學有限公司）;EBER原位雜交試劑盒[國食藥監(jiān)械（準）字2012第3400329號]：包括蛋白酶K（福建泰普生物科學有限公司）， 地高辛標記的EBER探針（江西仙巖生物科學有限公司）， 抗地高辛一抗及二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液（福建泰普生物科學有限公司）等;廣譜CK， 免疫組化超敏SAP染色試劑盒（江西仙巖生物科學有限公司）， 快紅和3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）顯色劑（江西仙巖生物科學有限公司）等;進口分裝Dako公司的Envision免疫組化檢測試劑。

1. 2. 2 方法

1. 2. 2. 1 原位雜交雙標記技術檢測步驟 ①切片常規(guī)脫蠟至水裱貼于經防脫處理的潔凈載玻片上;②滴加100 μl蛋白酶K液， 無水酒精脫水后進行干燥處理;③組織上滴加20 μl探針雜交液， 加上蓋玻片;④37℃下孵育3 h取出切片;⑤用含0.1%v/v TritonX-100的Tris緩沖鹽溶液沖洗;⑥室溫孵育10 min， 甩干;⑦加入兔抗FITC/抗核周因子（APF）（ab）室溫孵育30 min;⑧Tris緩沖鹽溶液沖洗5 min;⑨加入BCIP/NBT顯色液4℃孵育過夜， 蘇木精復染， 脫水、透明、封固。觀察檢測效果。

1. 2. 2. 2 免疫組化具體步驟 ①免疫組化挑選顯色后陽性表達的切片;②置入pH值為8.0的Tris-EDTA緩沖液中高壓修復90 s;③磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗， 然后用10%羊血清封閉孵育10 min;④PBS沖洗后滴加廣譜CK一抗100 μl，?稀釋度為1∶200;⑤PBS沖洗后滴加Envision二抗;⑥DAB顯色， 顯微鏡下仔細觀察顯色情況合適時中止顯色;⑦脫水、透明、封固。觀察檢測效果。

2 結果

免疫組化檢測結果顯示， 廣譜CK定位于細胞漿內。原位雜交雙標記技術檢測結果顯示， EBER陽性反應定位于鼻咽癌細胞的細胞核上。免疫組化檢測后的陽性細胞的胞膜表現(xiàn)為紅色， 原位雜交雙標記技術檢測后的陽性細胞核表現(xiàn)為藍黑色， 而雙陽性細胞的核與膜呈現(xiàn)藍紅色， 不僅對比鮮明同時背景十分清楚， 雙染成功后細胞及組織結構表現(xiàn)完整。

3 討論

鼻咽癌是我國常見癌癥類型之一， 其中鼻咽癌又分為角化性鱗狀細胞癌、非角化性癌以及基底樣鱗狀細胞癌。有學者指出鼻咽癌發(fā)病率為鼻咽部惡性腫瘤之首[4， 5]?，F(xiàn)目前的鼻咽癌的診斷方法缺乏靈敏度與特異性， 但最近又研究發(fā)現(xiàn) EB 病毒感染與鼻咽癌密切相關， 可能對鼻咽癌的診斷具有重要意義[6]。廣譜CK（AE1/AE3）染色是現(xiàn)目前鼻咽癌診斷中運用得最為廣泛的一個免疫組化指標， 因為鼻咽癌細胞 CK 呈陽性表達而肉瘤和淋巴瘤細胞 CK 呈陰性， 所以診斷效果令人滿意， 免疫組化這種傳統(tǒng)的檢測方法有助于鼻咽癌的病理診斷[7]。本次研究表明， 免疫組化檢測結果顯示， 廣譜CK定位于細胞漿內。原位雜交雙標記技術檢測結果顯示， EBER陽性反應定位于鼻咽癌細胞的細胞核上。免疫組化檢測后的陽性細胞的胞膜表現(xiàn)為紅色， 原位雜交雙標記技術檢測后的陽性細胞核表現(xiàn)為藍黑色， 而雙陽性細胞的核與膜呈現(xiàn)藍紅色， 不僅對比鮮明同時背景十分清楚， 雙染成功后細胞及組織結構表現(xiàn)完整。本研究結果與相關報道一致[8]。此外， 也有研究表明通過免疫組化檢測來幫助診斷鼻咽癌， 具有操作方便、步驟簡單的優(yōu)勢， 但無法檢出EB病毒的定位及轉錄數(shù)量， 因此往往被作為EB病毒的初步篩查方法[9-11]。

綜上所述， 免疫組化與原位雜交雙標記技術檢測EB病毒用于診斷鼻咽癌均有一定作用， 但原位雜交雙標記技術檢測比免疫組化方法更靈敏， 值得臨床推廣應用。

參考文獻

[1] 羅儉權， 曾秀英， 呂鏡雄， 等. 免疫組化與原位雜交雙標記技術檢測EB病毒用于診斷鼻咽癌. 實用檢驗醫(yī)師雜志， 2017， 9（2）：77-79.

[2] 劉泳冬， 梁英杰， 劉妮， 等. 免疫組化與原位雜交雙標記技術在鼻咽癌診斷中的應用. 臨床醫(yī)學工程， 2014， 21（3）：288-289.

[3] 楊麗， 杜俊， 劉東戈， 等. 用免疫組化及原位雜交方法檢測鼻咽癌EBV的比較. 診斷病理學雜志， 2005， 12（4）：320.

[4] 李三恩. 應用EBER-RNA探針原位雜交技術檢測鼻咽癌組織中的EB病毒. 中國血液流變學雜志， 2017， 27（1）：103-104.

[5] 畢佩， 王潔， 魯娟， 等. 鼻咽癌免疫逃逸中EB病毒募集Treg細胞相關性分析. 中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志， 2017， 52（9）：692.

[6] 王穎， 陳定寶， 沈丹華. 常規(guī)病理診斷中應用原位雜交和免疫組化方法檢測EB病毒的體會. 診斷病理學雜志， 2011， 18（2）：160.

[7] 郗彥鳳， 王晉芬， 王全紅， 等. 應用組織芯片探討凋亡及EB病毒與經典型Hodgkin淋巴瘤的關系. 腫瘤研究與臨床， 2004， 16（5）：300-302.

[8] 楊冬梅， 劉紅剛， 張勇. 酶聯(lián)免疫、免疫組化和原位雜交檢測EB病毒的比較研究. 臨床與實驗病理學雜志， 2008， 24（5）：642.

[9] 王勁， 陳森林， 劉保安. 石蠟切片中原位雜交和免疫組化檢測EB病毒的比較研究. 當代醫(yī)師雜志， 1997（6）：7-8.

[10] 李西啟， 鄒積才， 劉厚才，等. 地高辛素標記探針原位雜交法檢測鼻咽癌組織中EB病毒. 實用醫(yī)藥雜志， 1996（1）：23-24.

[11] 楊春青， 張煒明， 李百周. 免疫組化與原位雜交雙標記技術的方法學研究. 南京醫(yī)科大學學報：自然科學版， 2004（3）：316.

[收稿日期：2018-09-20]