元振杰，馬弘財(cái)，拉巴次旦，曾江勇

(西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏 拉薩 850009)

溶血性曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica，Mh)又稱溶血性巴氏桿菌，該菌屬于條件性致病菌，可長(zhǎng)期寄生于牛、綿羊、山羊等反芻動(dòng)物及其它動(dòng)物的上呼吸道[1-2]。當(dāng)受到外界環(huán)境氣候聚變、長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)却碳r(shí)，致使動(dòng)物機(jī)體抵抗力下降，病原可趁機(jī)侵入機(jī)體而致?。辉诎l(fā)生病毒和支原體感染如副流感病毒、綿羊肺炎支原體、多殺性巴氏桿菌病等，也可使該病的易感性增加[3-4]。一般認(rèn)為該菌只有毒力較強(qiáng)的致病菌才有致病性[5]，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)其報(bào)道的較多，它能夠引起牛和綿羊的肺炎、新生羔羊急性敗血癥，給養(yǎng)牛和養(yǎng)羊業(yè)帶來(lái)較大的經(jīng)濟(jì)損失，據(jù)報(bào)道全球30 %的病死牛與該病菌有關(guān)。該病每年給北美國(guó)家導(dǎo)致發(fā)經(jīng)濟(jì)損失已超過(guò)10億美元[2]。

2018年4月，西藏自治區(qū)日喀則市崗巴縣某養(yǎng)羊場(chǎng)發(fā)生疫情，每天病死綿羊5～10只，死亡率達(dá)10 %以上，發(fā)病綿羊主要表現(xiàn)為咳嗽、喘氣、呼吸急促、鼻流黏液等呼吸道癥狀，并伴有體溫升高、精神沉郁、四肢僵硬等其它癥狀。筆者采集其內(nèi)臟和血液樣本，通過(guò)病原分離培養(yǎng)、細(xì)菌16srRNA測(cè)序和產(chǎn)物比對(duì)，確定所分離的細(xì)菌為溶血性曼氏桿菌。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

5 %脫纖綿羊鮮血平板、5 %犢牛血清TSA瓊脂平板、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)、麥康凱瓊脂(MAC)培養(yǎng)基來(lái)自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病診斷中心實(shí)驗(yàn)室，PCR反應(yīng)體系、DNAmarker、核酸提取試劑購(gòu)自TaKaRa，核酸回收試劑盒購(gòu)自于北京全氏金生物技術(shù)有限公司，其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

發(fā)病綿羊?yàn)槲鞑刈灾螀^(qū)日喀則市崗巴縣某養(yǎng)羊場(chǎng)。實(shí)驗(yàn)用鼠為32日齡昆明系健康小白鼠8只，隨機(jī)分為2組，來(lái)自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病診斷中心實(shí)驗(yàn)室。

1.3 發(fā)病綿羊臨床癥狀與剖檢情況

發(fā)病綿羊主要表現(xiàn)為咳嗽、喘氣、呼吸急促、鼻流黏液等呼吸道癥狀，并伴有體溫升高、精神沉郁、四肢僵硬等其它癥狀。

通過(guò)對(duì)病死羊進(jìn)行剖檢，發(fā)現(xiàn)病死羊的胸腔有大量積液，肺部有嚴(yán)重淤血，氣管和支氣管黏膜有大量黏液分布，部分病死羊膽囊腫大，小腸充血嚴(yán)重。病理變化符合溶血血曼氏桿菌感染的基本特征。

無(wú)菌采集發(fā)病綿羊和瀕死綿羊頸靜脈血液5 mL，無(wú)菌采集瀕死綿羊和死亡綿羊心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、淋巴結(jié)組織樣品，送甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病診斷中心實(shí)驗(yàn)室通過(guò)病原分離培養(yǎng)、細(xì)菌16 srRNA測(cè)序和產(chǎn)物比對(duì)進(jìn)行分析。

1.4 病原的分離

將無(wú)菌采集發(fā)病綿羊頸靜脈血液，瀕死綿羊和死亡綿羊心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、淋巴結(jié)組織樣品，分別將其接種于5 %脫纖綿羊鮮血平板、5 %犢牛血清TSA瓊脂平板、MAC平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取單個(gè)菌落進(jìn)一步分離純化。觀察菌落特征，并挑取單個(gè)菌落進(jìn)行涂片革蘭氏染色鏡檢，所有試驗(yàn)在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病診斷中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.5 致病性試驗(yàn)

將所分離的單個(gè)菌落分別接種于含犢牛血清的TSA液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)后的菌液0.5 mL腹腔分別注射給已分好組的小白鼠，別外一組腹腔注射0.5 mL生理鹽水做為對(duì)照，觀察并記錄小白鼠發(fā)病及死亡情況。對(duì)死亡的小白鼠進(jìn)行剖檢，采集肺、肝、脾等發(fā)病組織進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。

1.6 分離菌的16SrRNA擴(kuò)增與序列分析

試驗(yàn)在采用常規(guī)的方法用基因提取試劑盒，對(duì)分離的細(xì)菌提取DNA，以提取的DNA為模板，使用16SrRNA通用引物(上游引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；下游引物：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目標(biāo)片斷約為1400 bp。PCR反應(yīng)體系為：PCR-MIX12.5 μl,ddH2O 9.5 μl，模板1 μl，上下游引物各1 μl。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 40 s，72 ℃ 45 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠后通過(guò)膠回收試劑盒回收目的基因片斷，然后送住西安擎科生物進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果通過(guò)在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.gov/BLAST)進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，確定該細(xì)菌的種屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床與剖檢診斷

根據(jù)發(fā)病綿羊和瀕死綿羊的臨床癥狀與剖檢瀕死綿羊和死亡綿羊的剖檢病理變化，符合溶血性曼氏桿菌感染的基本特征，即初步診斷為綿羊溶血性曼氏桿菌病。

2.2 細(xì)菌的分離與培養(yǎng)

通過(guò)對(duì)12份病變樣本分別接種于5 %脫纖綿羊鮮血平板、5 %犢牛血清TSA瓊脂平板、MAC平板培養(yǎng)24 h后，在所有采集的肺病料中均培養(yǎng)大量呈圓形、光滑、具有溶血性、半透明的小菌落。革蘭氏染色呈革蘭氏陰性、短小的桿菌(圖1)。

2.3 分離菌株16SrRNA基因序列擴(kuò)增與分析

以3株分離菌株的基因組為DNA模板，采用16 srRNA通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果可見約1400 bp的特異性條帶，與預(yù)期的目的片斷一致(圖2)。測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI中GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，確定為溶血性曼氏桿菌(圖3)。

圖1 分離的細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察

M：DNA marker 2000；1、2、3為樣本圖2 分離菌株P(guān)CR擴(kuò)增電泳檢測(cè)

2.4 致病性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)組小白鼠在腹腔注射后約6 h后開始出現(xiàn)動(dòng)作緩慢、精神沉郁；12 h后約有75 %死亡(3/4)；在試驗(yàn)24 h試驗(yàn)組小白鼠全部死亡；生理鹽水對(duì)照組正常，未出現(xiàn)發(fā)病癥狀。對(duì)死亡的小白鼠進(jìn)行剖檢，發(fā)現(xiàn)其肺部嚴(yán)重出血淤血，取樣品進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，分離到與試驗(yàn)結(jié)果相同的菌株。

2.5 試驗(yàn)結(jié)果分析

本研究通過(guò)對(duì)西藏自治區(qū)日喀則市崗巴縣某羊場(chǎng)患病羊的內(nèi)臟組織進(jìn)行病原分離，經(jīng)菌落形態(tài)、染色鏡檢初步鑒定該細(xì)菌為溶血性曼氏桿菌，再結(jié)合PCR方法對(duì)細(xì)菌16 S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增和序列比對(duì)分析，最終確定為該菌為溶血性曼氏桿菌。通過(guò)實(shí)驗(yàn)小白鼠動(dòng)物致病性試驗(yàn)表明該菌株具有很強(qiáng)的致病性。

3 討 論

溶血性曼氏桿菌是牛和羊上呼吸道的一種常在的共生菌，一般認(rèn)為毒力較強(qiáng)的致病菌才有致病性[6]，該菌主要引起肺炎、新生羔羊、羊乳腺炎等，也是犢?！按\(yùn)熱”的主要病原，其大多數(shù)可以是從肺臟中分離得到，也有少數(shù)從鼻腔拭子中成功分離的報(bào)到[7-8]。目前該病國(guó)外對(duì)其的報(bào)道較多，每年給北美國(guó)家的養(yǎng)牛業(yè)造成了很大的損失[9]。在國(guó)內(nèi)也有相關(guān)報(bào)到，馮旭飛等對(duì)四川地區(qū)臨床采集的 120 份肺組織和鼻拭子進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果檢出率達(dá)51.67 %[10]；李娟等、徐慧等和李雪霞等分別證實(shí)了該病原在江蘇、新疆和云南地區(qū)的流行[8,11-12]。

圖3 16s rRNA NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果

結(jié)合調(diào)研及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果，此次發(fā)病的主要原因?yàn)椋阂皇秋曫B(yǎng)管理方式的突然轉(zhuǎn)變。在發(fā)生此病之前，該羊殖場(chǎng)的羊均在在A鄉(xiāng)放牧飼養(yǎng)，后突然轉(zhuǎn)到B鄉(xiāng)進(jìn)行集中圈舍養(yǎng)殖，且路途較遠(yuǎn)，可能是該病發(fā)生的誘因。二是因飼草料不足，致使羊群整體營(yíng)養(yǎng)不良、體質(zhì)較差、抵抗力較差，是致使發(fā)病的內(nèi)在因素。三是因B鄉(xiāng)晝夜溫差較大，基礎(chǔ)設(shè)施條件較差，部分羊發(fā)生了呼吸道疾病，沒有得到及時(shí)的治療，且有寄生蟲病感染，致使共生菌乘虛而入，是此次外病的外來(lái)因素，最終致使此次疾病的發(fā)生。因此，為有效防控該病的發(fā)生，建議采取以下措施：一是加強(qiáng)補(bǔ)飼青干草及精料，補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)需求，提高免疫力。二是改善飼養(yǎng)條件，夜間采取防風(fēng)保暖措施。三是加強(qiáng)管理，減少飼養(yǎng)管理方式的轉(zhuǎn)變和運(yùn)輸期間的不適應(yīng)、應(yīng)激情況。四是制定有效的治療計(jì)劃，加強(qiáng)環(huán)境衛(wèi)生和消毒工作，選用敏感藥物進(jìn)行對(duì)癥治療。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，溶血性曼氏桿菌已對(duì)部分藥物如物如氨基糖苷類、四環(huán)素類、磺胺類和β-內(nèi)酰胺類藥物產(chǎn)生了耐藥性[13-14]，在臨床治療時(shí)應(yīng)選用大多數(shù)敏感性較高的諾氟沙星、阿米卡星、美洛西林、多西環(huán)素、頭孢噻肟等藥物進(jìn)行治療[15-16]。