佴逸凡，馮 莉，廖劍橋，馬 琦，伯繼芳，李 梅*，徐懷德*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

隨著人們生活水平的提高，人的壽命逐漸延長，但人口老齡化帶來的老年性疾病越來越多，慢性神經(jīng)退行性疾病發(fā)病率也逐漸增加，其中阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種影響認(rèn)知和行為的神經(jīng)退行性疾病，臨床持續(xù)時間長，記憶障礙是其最常見的癥狀[1]，常用膽堿能損傷學(xué)說來解釋。AD與膽堿能系統(tǒng)中的酶有關(guān)，特別是乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）過度分解乙酰膽堿成為乙酸和膽堿[2]，并導(dǎo)致乙酰膽堿缺陷和認(rèn)知功能障礙。國內(nèi)外用于治療AD的藥物有膽堿酯酶抑制劑[3]和谷氨酸受體拮抗劑[4]，但藥物具有副作用，且維持時間短[5]。植物性食物安全性高且具有多種營養(yǎng)因子，將其添加到飲食中可以作為預(yù)防AD的一種有效方式[6]。植物多酚、黃酮類物質(zhì)具有營養(yǎng)神經(jīng)功能，可以用于預(yù)防和治療AD[7-10]，Luchtman等的研究表明n-3多不飽和脂肪酸通過促進(jìn)神經(jīng)元生長從而恢復(fù)認(rèn)知障礙或神經(jīng)元缺陷[11]。

中國傳統(tǒng)飲食觀念認(rèn)為核桃益智健腦。中國是世界上最大的核桃生產(chǎn)和消費(fèi)國，核桃種植面積達(dá)5 000萬 km2，總產(chǎn)量超過300萬 t，而且核桃含質(zhì)量分?jǐn)?shù)17%的蛋白質(zhì)和近70%的脂質(zhì)[12]，其中主要的脂肪酸是油酸、亞油酸和亞麻酸等不飽和脂肪酸，且比例合適[13]。核桃中還含有許多其他神經(jīng)保護(hù)成分，包括VE、葉酸、褪黑素[14]和高含量的抗氧化多酚[15]。Calcabrini等認(rèn)為核桃仁提取物作為膳食補(bǔ)充劑可以促進(jìn)健康，預(yù)防以及治療與生活方式有關(guān)的氧化疾病[16]。以往的研究表明，在食物中添加核桃可以提高動物的記憶、認(rèn)知和運(yùn)動功能[17-19]。

東莨菪堿可通過拮抗毒蕈堿乙酰膽堿受體阻斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膽堿能功能[20]，是常用的小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力損傷建模方法[21]。腹腔內(nèi)注射東莨菪堿不僅可引起記憶障礙，造成海馬中總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶的活性降低，脂質(zhì)過氧化指標(biāo)丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量升高，而且可以引起大腦中活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生[22]，大腦中產(chǎn)生過量的ROS將導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙，進(jìn)一步導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病甚至死亡[23]。鄧海峰等用行為學(xué)和電生理學(xué)等方法證明褪黑素能夠增強(qiáng)乙?；D(zhuǎn)移酶的活性，改善中樞膽堿能系統(tǒng)，對東莨菪堿誘導(dǎo)的大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙有明顯的改善作用[24]。但核桃對東莨菪堿誘導(dǎo)的小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力損傷是否有預(yù)防作用仍不清楚。因此，本研究用東莨菪堿建立小鼠記憶障礙模型，將核桃添加到小鼠飼料中，探究核桃對小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力損傷的預(yù)防作用。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級昆明雄性小鼠，體質(zhì)量28～32 g，由西安交通大學(xué)實驗動物中心提供（生產(chǎn)許可證號：SCXK（陜）2012-003）。飼養(yǎng)條件：溫度22～26 ℃、濕度50%～70%，采用12 h晝夜間斷照明。動物自由進(jìn)食、飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。

核桃仁 宜君縣益智源有機(jī)核桃開發(fā)有限公司；動物飼料 西安交通大學(xué)實驗動物中心；吡拉西坦片宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司；氫溴酸東莨菪堿注射液上海禾豐制藥有限公司；蛋白定量試劑盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒、MDA試劑盒、T-SOD試劑盒、AChE試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng) 北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司；T10 basic ULTRA-TURRAX?小型分散機(jī) 德國IKA集團(tuán)；UV-1780紫外-可見分光光度計日本島津公司；HC-3018R高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；超低溫保存箱 中國澳柯瑪股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與給藥

將動物飼料與核桃分別磨成粉末，然后以核桃質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%或9%的比例混勻，加入適量的純凈水?dāng)嚢杈鶆?，擠壓成型、烘干，制成核桃質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為6%和9%的低劑量、高劑量核桃飼料。

將昆明小鼠隨機(jī)分為7 組，每組10 只，分別為空白組、核桃高劑量組和低劑量組、模型組、陽性對照組、高劑量核桃預(yù)防組和低劑量核桃預(yù)防組。陽性對照組灌胃0.01 mL/g（以體質(zhì)量計）800 mg/kg吡拉西坦[25]，其余組給予等量的純凈水；同時，核桃高劑量組和高劑量預(yù)防組、核桃低劑量組和低劑量預(yù)防組分別喂食含質(zhì)量分?jǐn)?shù)9%或6%核桃的飼料。連續(xù)喂養(yǎng)8 周，于第8周進(jìn)行Morris水迷宮行為學(xué)測試，在測試前30 min，模型組、陽性對照組、核桃高劑量預(yù)防組和低劑量預(yù)防組分別腹腔注射0.01 mL/g（以體質(zhì)量計）3 mg/kg東莨菪堿[26]，建立記憶障礙模型，其余組腹腔注射等量的生理鹽水。

1.3.2 Morris水迷宮行為學(xué)測試

Morris水迷宮為直徑120 cm、高50 cm的圓形水池，水溫保持在21～23 ℃，迷宮上方安裝攝像機(jī)，記錄小鼠運(yùn)動軌跡。將水池等分為4 個象限，平臺置于第4象限的中間位置。實驗前，將小鼠放入水迷宮中自由游泳1 min，以適應(yīng)水溫、熟悉環(huán)境。

定位航行實驗：第1天訓(xùn)練時，將平臺置于高出水面1 cm處，小鼠分別從平臺之外的另外3 個不同的象限入水，每次入水之前在平臺上停留30 s，找到平臺后再停留30 s；對于超過60 s找不到平臺的小鼠，將其引導(dǎo)至平臺后停留30 s。第2～5天，將平臺置于低于水面1 cm處，水中添加黑色素。實驗時將小鼠從不同象限面向池壁放入水中，記錄小鼠找到平臺并停留3 s以上的時間，此為逃避潛伏期。超過60 s找不到平臺的小鼠逃避潛伏期記為60 s，并將其引導(dǎo)至平臺停留30 s。記錄小鼠在訓(xùn)練期間的逃避潛伏期和找到平臺的游泳總路程。

空間探索實驗：實驗第6天將平臺撤去，其他條件同上，測定小鼠60 s內(nèi)在平臺所在象限停留的時間、穿越平臺所在空間的次數(shù)（穿臺次數(shù)），其在平臺所在空間的游泳路程與其游泳總路程的百分比為目標(biāo)象限路程占比。

1.3.3 生化指標(biāo)測定

行為學(xué)測試后的第2天，所有小鼠禁食不禁水12 h后稱體質(zhì)量并記錄。斷頭處死小鼠，準(zhǔn)確稱取腦組織質(zhì)量，按料液比1：9加入生理鹽水，冰水浴條件下機(jī)械勻漿，4 000 r/min離心10 min，取上清液，-80 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作，分別檢測各組小鼠腦組織中MDA含量、GSH含量、T-SOD活力和AChE活力。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有數(shù)據(jù)均以 ±s表示。使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。用Excel軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃對小鼠Morris水迷宮空間記憶影響

2.1.1 定位航行實驗結(jié)果

如表1所示，隨著訓(xùn)練時間的延長，小鼠的運(yùn)動表現(xiàn)得到改善，所有組小鼠的逃避潛伏期均縮短。方差分析結(jié)果顯示，各組小鼠訓(xùn)練期間的平均潛伏期有顯著差異（P＜0.05），但是沒有觀察到訓(xùn)練時間和處理方式間的相互作用（P＞0.05）（未在表中顯示）。在整個訓(xùn)練期間，與空白組小鼠相比，模型組小鼠需要花費(fèi)更長的時間找到平臺。結(jié)果顯示，東莨菪堿處理會對小鼠造成明顯的認(rèn)知功能障礙。訓(xùn)練第3～4天，與空白組相比，喂食兩種質(zhì)量分?jǐn)?shù)的核桃飼料均顯著縮短了小鼠的逃避潛伏期（P＜0.05）。與模型組相比，攝入核桃飼料和吡拉西坦的記憶障礙小鼠的逃避潛伏期在第4天顯著縮短（P＜0.05）。

表1 低劑量和高劑量的核桃飲食對小鼠水迷宮實驗逃避潛伏期的影響Table 1 Effects of low-dose and high-dose walnut kernel on escape latency in water maze test

表2 低劑量和高劑量的核桃飲食對小鼠水迷宮實驗游泳總路程的影響Table 2 Effects of low-dose and high-dose walnut kernel on total distance traveled in water maze test

如表2所示，隨著訓(xùn)練時間的延長，各組小鼠的游泳總路程逐漸減少。與空白組小鼠相比，在訓(xùn)練第2天，攝入核桃飼料小鼠的游泳總路程顯著減少（P＜0.05）；模型組小鼠的游泳總路程從第2天起顯著多于空白組（P＜0.05）。喂食核桃飼料后，高劑量核桃預(yù)防組小鼠與模型組相比訓(xùn)練第2～4天游泳總路程顯著減少。

2.1.2 空間探索實驗結(jié)果

表3 低劑量和高劑量的核桃飲食對小鼠水迷宮實驗?zāi)繕?biāo)象限停留時間、穿臺次數(shù)及目標(biāo)象限路程占比的影響Table 3 Effects of low-dose and high-dose walnut kernel on time spent in target quadrant, number of punctures, and percentage distance traveled in target quadrant

在空間探索實驗中，與空白組相比，攝入高劑量核桃飲食的小鼠在目標(biāo)象限停留的時間由12.08 s延長至17.79 s（表3），目標(biāo)象限路程所占比顯著增加至28.38%（P＜0.05）；東莨菪堿處理后的小鼠在目標(biāo)象限停留的時間縮短至7.03 s（P＜0.05），穿臺次數(shù)顯著減少（P＜0.05），且目標(biāo)象限路程占比顯著減少到14%（P＜0.05）。攝入高劑量核桃飼料的記憶障礙小鼠在目標(biāo)象限停留的時間為10.48 s，顯著長于模型組（P＜0.05），穿臺次數(shù)及目標(biāo)象限路程占比顯著增加（P＜0.05）。吡拉西坦飼喂也顯著延長了記憶障礙小鼠在目標(biāo)象限的停留時間，并增加穿臺次數(shù)及目標(biāo)象限路程占比（P＜0.05）。

Morris水迷宮實驗結(jié)果表明，喂食核桃飼料可以改善小鼠的學(xué)習(xí)能力，攝入高劑量核桃飼料的小鼠表現(xiàn)出更好的學(xué)習(xí)記憶能力。東莨菪堿可以造成空間學(xué)習(xí)和記憶功能方面的損傷，而核桃可以預(yù)防東莨菪堿造成的學(xué)習(xí)記憶障礙。

2.2 核桃對小鼠腦組織中AChE活力的影響

圖1 核桃飲食對小鼠腦組織中AChE活力的影響Fig. 1 Effect of walnut kernel on AChE activity in brain tissues of mice

如圖1所示，與空白組相比，攝入高劑量核桃飼料小鼠的AChE活力顯著降低（P＜0.05），而東莨菪堿可引起小鼠腦組織中AChE活力極顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，喂食吡拉西坦、高劑量及低劑量的核桃飼料可顯著降低記憶障礙小鼠腦組織中的AChE活力（P＜0.05），預(yù)防東莨菪堿造成的記憶損傷。其中，高劑量核桃預(yù)防組的AChE活力較模型組由1.48 U/mg降低至0.95 U/mg。

中樞膽堿能系統(tǒng)與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)，乙酰膽堿是重要的神經(jīng)遞質(zhì)之一，在學(xué)習(xí)記憶中起重要作用[27]。AChE作為膽堿能神經(jīng)元的生理活性特異性標(biāo)記物的蛋白質(zhì)，在神經(jīng)元乙酰膽堿的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[2]，因此常將AChE活力的變化作為判斷AD的生物標(biāo)志物。研究結(jié)果顯示，腹腔注射東莨菪堿后，小鼠腦組織中的AChE活力升高，表明東莨菪堿不僅可以損傷小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶功能，還能引起小鼠腦組織中的膽堿能系統(tǒng)功能障礙。高劑量的核桃飲食可以顯著抑制AChE的活力，該結(jié)果與小鼠行為數(shù)據(jù)一致，表明核桃可以通過維持膽堿能系統(tǒng)的穩(wěn)定來提供神經(jīng)保護(hù)作用。

2.3 核桃對小鼠腦組織中MDA、GSH含量和T-SOD活力的影響

圖2 喂食核桃飼料對小鼠腦組織MDA含量（A）、T-SOD活力（B）及GSH含量（C）的影響Fig. 2 Effect of walnut kernel on MDA level (A), T-SOD activity (B)and GSH content (C) in brain tissues of mice

如圖2所示，與空白組相比，高劑量的核桃飲食可顯著降低小鼠MDA含量，提高GSH含量（P＜0.05）；模型組小鼠腦組織中MDA含量顯著升高（P＜0.05），T-SOD活力及GSH含量顯著降低（P＜0.05）。陽性對照組和高劑量核桃預(yù)防組小鼠的MDA含量（分別為11.59、11.65 nmol/mg）顯著低于模型組（P＜0.05），同時T-SOD活力（分別為96.05、93.36 U/mg）和GSH含量（分別為71.29、69.53 mg/g）較模型組顯著升高（P＜0.05）。

氧化應(yīng)激是AD發(fā)病和加重的主要因素之一[28]。SOD、GSH和MDA是氧化應(yīng)激的3 個主要生物標(biāo)志物。SOD和GSH是抑制自由基產(chǎn)生的重要的抗氧化劑[29]，MDA是生物膜脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，通常被認(rèn)為是脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志物[30]。哺乳動物的大腦中，以磷脂為主的脂質(zhì)約占大腦干質(zhì)量的60%，且n-3和n-6多不飽和脂肪酸含量豐富，占大腦脂肪酸總量的30%～35%[11]，適當(dāng)補(bǔ)充二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸可改善老年嚙齒動物認(rèn)知障礙[31]，長期攝入α-亞麻酸可以調(diào)節(jié)自然衰老大鼠腦組織中的脂肪酸含量，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)神經(jīng)元，改善其學(xué)習(xí)記憶能力[32]。由于飲食中的n-6/n-3脂肪酸比例過高可引起智力發(fā)育遲緩、神經(jīng)退行性疾病等大腦功能損傷的風(fēng)險[33]，降低n-6/n-3脂肪酸比例可以調(diào)節(jié)大腦先天性免疫系統(tǒng)活性，抵抗脂多糖誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生和隨后的空間記憶改變[34]。因此保持n-6/n-3脂肪酸比例平衡對大腦發(fā)育尤為重要。核桃以約1：4的比例提供的α-亞麻酸和亞油酸，可能對改善記憶障礙小鼠大腦抗氧化能力發(fā)揮重要作用[35-36]。

核桃中的多不飽和脂肪酸在改善小鼠記憶及認(rèn)知能力方面發(fā)揮重要作用，其他化學(xué)成分也通過改善大腦的抗氧化能力提供了一定的神經(jīng)保護(hù)作用[37]。Aydin等的研究表明核桃中的維生素、類黃酮對腦組織中脂質(zhì)過氧化物的形成具有保護(hù)作用[38]。在山核桃、榛子、核桃、花生、杏仁、腰果、開心果、松子仁等多種堅果中，山核桃中的酚類物質(zhì)含量最高，總酚含量約為19.4 mg/g[39]，其中主要的酚類化合物為可水解的單寧，約占總酚含量的60.8%，其次是黃烷醇，核桃中還含有沒食子酸、鞣花酸等[40-41]。多酚作為食品中的一種強(qiáng)抗氧化劑可以降低AD的患病風(fēng)險，預(yù)防因年齡增長引起的認(rèn)知能力下降[42-43]。核桃中的酚類物質(zhì)顯著降低高膽固醇血癥小鼠腦組織中MDA含量，增加SOD活性，改善小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力[44]。核桃內(nèi)種皮中的多酚可減輕D-半乳糖導(dǎo)致的氧化損傷，具有一定的抗氧化能力[45]，因此，核桃多酚在減少大腦的氧化應(yīng)激中可能起到重要作用。

核桃中的褪黑素可以通過直接清除ROS及減少ROS的產(chǎn)生，降低自由基對蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜的損害，對大腦中產(chǎn)生的氧化應(yīng)激具有一定的保護(hù)作用[46-48]。同時，褪黑素的神經(jīng)保護(hù)作用與其對細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)和膽堿能系統(tǒng)的保護(hù)有關(guān)[49]。長期進(jìn)行褪黑素處理可以降低大腦的氧化應(yīng)激水平，提高海馬區(qū)SOD活性，降低MDA含量[50-51]，改善認(rèn)知障礙患者的認(rèn)知能力，對神經(jīng)退行性疾病患者具有神經(jīng)保護(hù)作用[52]。

本研究結(jié)果顯示，模型組中GSH含量和T-SOD活力顯著低于空白組，MDA含量顯著高于空白組，經(jīng)喂食核桃飼料干預(yù)后，GSH含量和T-SOD活力顯著增加，MDA含量顯著降低。因此，核桃可以改善氧化應(yīng)激相關(guān)因素的變化，保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)免受氧化損傷，可能與其中含有的大量多不飽和脂肪酸、多酚類化合物、褪黑素等其他植物化學(xué)物質(zhì)的協(xié)同作用有關(guān)。

以上結(jié)果表明，東莨菪堿處理可以在學(xué)習(xí)和記憶功能方面造成損傷，引起小鼠腦組織中膽堿能系統(tǒng)障礙。核桃飲食可以通過提高T-SOD活力、抑制AChE活力，預(yù)防由東莨菪堿誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙。

3 結(jié) 論

用東莨菪堿建立小鼠記憶障礙模型，通過Morris水迷宮評估小鼠學(xué)習(xí)和記憶表現(xiàn)，并對其腦組織中的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測。與模型組相比，在Morris水迷宮實驗中，核桃高劑量預(yù)防組的逃避潛伏期在第4天極顯著縮短（P＜0.01），穿臺次數(shù)顯著增加（P＜0.05），目標(biāo)象限停留時間及路程占比分別顯著延長和提高（P＜0.05）。同時，小鼠腦組織中AChE活力（（0.94±0.08）U/mg）、MDA含量（（11.64±0.58）nmol/mg）顯著降低（P＜0.05），GSH含量（（69.53±2.11）mg/g）、T-SOD活力（（93.36±4.94）U/mg）顯著提高（P＜0.05）。結(jié)果表明，攝入核桃可以提高小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，并通過抑制其大腦氧化損傷和增強(qiáng)膽堿能功能，對東莨菪堿誘導(dǎo)的AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

根據(jù)人與動物等效劑量換算比例，小鼠攝入的質(zhì)量分?jǐn)?shù)9%的核桃飼料大約相當(dāng)于成人食用42 g核桃，約4～5 個。因此，核桃可以作為延緩大腦衰老、預(yù)防AD發(fā)生及延緩其惡化的一種有效方式，然而其中對學(xué)習(xí)和記憶能力具有保護(hù)作用的組分及其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。