胡玲萍，張曉梅，張鴻偉,，孫維維，溫運啟，林黎明，薛長湖,*，姜曉明,*

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003；2.青島海關技術(shù)中心，山東 青島 266002）

南極磷蝦是一類生活在南極海域的甲殼動物，隸屬于節(jié)肢動物門（Arthropoda）、甲殼綱（Crustacea）、磷蝦目（Euphausiacea）、磷蝦科（Euphausiidae）、磷蝦屬（Euphausia），約有7～8 個種[1-3]，主要包含了如南極大磷蝦、長額磷蝦、長額櫻磷蝦等在內(nèi)的8 種磷蝦。通常所說的和進行商業(yè)捕撈的南極磷蝦指的是南極大磷蝦（Euphausia superba）[4]。南極磷蝦總的生物量為1.17×109～3.79×109t[5]，是目前已知的地球上數(shù)量最大、繁衍最成功的單種生物資源之一[6]。尤其在近海漁業(yè)資源日漸枯竭的今天，南極磷蝦被視為一種潛力巨大的漁業(yè)資源[5]。

南極磷蝦體內(nèi)，尤其是頭胸部的消化系統(tǒng)，分布著豐富且活性較強的自溶酶[7]，使其極易發(fā)生自溶[8-10]，主要是蛋白酶類和酯酶類，該酶系同時具有外切酶和內(nèi)切酶的活性[11]。據(jù)報道南極磷蝦蛋白酶主要包括8 種自溶酶：3 種絲氨酸類胰蛋白酶、1 種絲氨酸類胰凝乳蛋白酶、2 種羧肽酶A（carboxypeptidase A enzyme，CPA）（CPA I、CPA II）、2 種羧肽酶B[7,12]。Kubota等[13]研究認為對自溶起關鍵作用的是位于頭胸部的消化管道內(nèi)的蛋白酶，該類酶的最適pH值為6～8。Kimoto[14]、Konagaya[15]等經(jīng)研究認為，對南極大磷蝦自溶起主導作用的是類胰蛋白酶。任艷分析磷蝦粗酶中主要含有3 種蛋白酶，其最適pH值分別為3.0、6.0和7.5；pH 3.0時蛋白酶有較高的分解酪蛋白的能力及熱穩(wěn)定性，表現(xiàn)為類胃蛋白酶屬性；pH 6.0時蛋白酶熱穩(wěn)定性比較弱，能被苯甲基磺酰氟抑制，表現(xiàn)為CPA屬性；pH 7.0時蛋白酶有較高的活性，能被大豆胰蛋白酶抑制劑抑制，表現(xiàn)為類胰蛋白酶屬性[12]。

南極磷蝦肌肉中含有約78%的蛋白質(zhì)，且含有18 種常見氨基酸，其中包括8 種人體必需氨基酸，氨基酸總量為57.21%，其中必需氨基酸含量為25.88%，其構(gòu)成比例符合聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO）和世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）的標準[16-17]。南極磷蝦自溶后可以產(chǎn)生更加豐富的氨基酸、多肽等，利用它們來制備天然的魚醬油、食源肽，可以降低由于添加商業(yè)蛋白酶而引起的高加工成本，使南極磷蝦的加工過程更加經(jīng)濟[18]。影響自溶的主要因素有3 種：物理、化學和生物因素[19]，其中物理因素包括溫度、輻射和機械等；化學因素包括pH值、鹽離子強度等；生物因素包括外源生物酶的使用等。不同因素對自溶酶的影響不同，因此可以通過控制內(nèi)源酶的活性來抑制自溶，也可以通過控制自溶酶的活性促進自溶來制備相關的磷蝦類產(chǎn)品。尤其在利用自溶進行工藝優(yōu)化時，要根據(jù)自溶酶的特點，發(fā)揮有利因素而避免不利因素。本研究初步探索了南極磷蝦自溶的最適條件，并在該條件下使南極磷蝦發(fā)生自溶，研究自溶前后的氨基酸態(tài)氮、氨基酸、多肽的變化，為自溶技術(shù)在南極磷蝦加工利用方面提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍南極磷蝦 中國水產(chǎn)有限公司。

測序級胰蛋白酶（比活力為18 523 U/mg） 美國Promega公司；質(zhì)譜級甲酸（純度＞98%） 瑞士Fluka公司；乙腈 美國Fisher公司；二硫蘇糖醇、尿素、碳酸氫銨、鹽酸 國藥集團化學試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane，THAM） 北京索萊寶科技有限公司；N-苯甲酰基-DL-精氨酰-對硝基苯胺（N-α-benzoyl-DL-arginine p-nitroanilide，BApNA）、碘代乙酰胺 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

30 Ltd型氨基酸自動分析儀 英國Biochrom公司；Q-TOF?5600質(zhì)譜儀 美國AB SCIEX公司；Nexera X2 30A高效液相色譜儀 日本島津公司；MQS50001型超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司；722型可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；AB135-S型精密電子分析天平 瑞士Mettler-Toledo公司；T18 ULTRATURRAX高速分散機 德國IKA集團。

1.3 方法

1.3.1 南極磷蝦粗酶液的制備

收集冷凍南極磷蝦蝦頭，加入2 倍質(zhì)量預冷至4 ℃的0.05 mol/L pH 7.5的Tris-HCl緩沖液，高速勻漿后，勻漿液4 ℃、10 000 r/min離心30 min，收集上清液，用Waterman No.1濾紙過濾以除去脂類，得南極磷蝦粗酶液。

1.3.2 不同溫度、pH值條件下自溶酶相對活力的測定

參考Erlanger等[20]的方法測定自溶酶相對活力。以BApNA為底物，以410 nm波長處吸光度最高的溫度所對應的酶活力為100%，測定粗酶液中自溶酶在不同溫度（5～65 ℃）下的相對活力；在55 ℃反應溫度下，以波長410 nm處吸光度最高的pH值所對應的酶活力為100%，測定粗酶液中自溶酶在不同pH值（3～11）下的相對活力。

1.3.3 南極磷蝦自溶前后氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度和游離氨基酸質(zhì)量分數(shù)的測定

在南極磷蝦自溶酶最適反應溫度和pH值下，使南極磷蝦自溶3 h，測定自溶前后氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度和游離氨基酸質(zhì)量分數(shù)的變化。氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度的測定：將自溶前后的溶液pH值調(diào)為4.5，冰水中靜置30 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液利用甲醛滴定法[21]測定氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度。

游離氨基酸質(zhì)量分數(shù)的測定采用磺基水楊酸法，具體操作為：稱取5 g上清樣品，加入15 mL 0.02 mol/L的鹽酸溶液，充分均質(zhì)后用0.02 mol/L的鹽酸溶液定容至50 m L，3 000 r/min離心10 min。取上清液2 mL加入等體積8 g/100 mL的磺基水楊酸溶液，在4 ℃冰箱里靜止放置30 min后，1 000 r/min離心10 min。取2 mL離心后的上清液，加入2 mL正己烷，混合后10 000 r/min下離心10 min，收集下層液體，過0.22 μm濾膜后利用氨基酸分析儀上樣測定。

1.3.4 南極磷蝦自溶前后胰蛋白酶降解產(chǎn)物的制備

參照Wi?niewski[22]、Mi Rui[23]等的方法，分別取1 g自溶前后的凍干樣品，分別用10 mL蛋白提取液（含8 mol/L尿素、50 mmol/L NH4HCO3），垂直振蕩30 min后，高速低溫離心20 min（4 ℃、15 000 r/min）。取上清液，分成3 份，每份100 μL，分別加入2 μL 1 mol/L二硫基蘇糖醇，在恒溫培養(yǎng)箱中60 ℃反應1 h，冷卻至室溫后，加入5 μL 1 mol/L現(xiàn)配的碘代乙酰胺，室溫避光反應1 h。采用10 kDa截留分子質(zhì)量的超濾離心管在15 000 r/min離心20 min后，每次用200 μL 50 mmol/L NH4HCO3溶液洗滌膜上層蛋白3 次。最后在膜上層加入200 μL 50 mmol/L NH4HCO3溶液作為緩沖液，并按酶與底物質(zhì)量比1∶50將胰蛋白酶溶液加入到上述蛋白溶液中，混勻并在37 ℃酶解16 h，使酶解徹底。用超濾離心管15 000 r/min離心超濾20 min，收集下層的肽段濾液。

1.3.5 肽段的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測

色譜條件：色譜柱：AdvanceBio Peptide Map柱（150 mm×2.1 mm，130 ?，2.7 μm）；柱溫：40 ℃。流動相A：體積分數(shù)0.1%甲酸-乙腈，流動相B：體積分數(shù)0.1%甲酸-水；流速：0.25 mL/min；進樣量：30 μL；時間：46 min；流動相梯度：0～2 min，95% B；2～17 min，95%～80% B；27～37 min，85%～65% B；37～39 min，65%～20% B；39～42 min，20%～95% B；42～46 min，95% B。

質(zhì)譜條件：質(zhì)譜掃描范圍：350～1 500 Da，正離子反應模式，霧化氣GS1：241 kPa，輔助加熱器GS2：310 kPa，氣簾氣壓241 kPa，噴霧電壓5 500 eV，離子源溫度500 ℃，解簇電壓100 V，碰撞能量10 eV，信號強度閾值：2×104。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用MarkerViewTM和ProteinPilotTM軟件進行數(shù)據(jù)的處理和分析，選用NCBI的南極磷蝦蛋白數(shù)據(jù)庫（Euphausua superba. fasta）進行數(shù)據(jù)檢索。MarkerView軟件設置如下：最小保留時間2 min，最大保留時間40 min；設置數(shù)據(jù)的組的分類標志；進行正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA），選取Pareto方法。ProteinPilot軟件參數(shù)設置如下：搜庫方法：Paragon method；消化：Trypsin；儀器：Q-TOF 5600；物種：None；ID Focus：Amino acid Subtitutions，Biological modifications；Search Effort：Thorough ID；檢測蛋白質(zhì)置信度：95%；提交錯誤發(fā)現(xiàn)率分析報告。使用Origin 9.2軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 南極磷蝦蛋白自溶酶相對活力的變化

圖1 南極磷蝦蛋白自溶酶在不同溫度（A）、pH值（B）下的相對活力Fig. 1 Relative activity of autolytic enzymes from Antarctic krill at different temperatures (A) and pH (B)

由圖1A可以看出，5～35 ℃范圍內(nèi)，南極磷蝦自溶酶的相對活力隨溫度升高緩慢升高，之后迅速升高，在55 ℃處達到峰值，之后又開始下降。由圖1B可以看出，在pH 3.0～7.5范圍內(nèi)，南極磷蝦自溶酶的相對活力隨pH值升高逐漸升高，pH 7.5時活力達到最高值，之后又逐漸下降。因此，南極磷蝦自溶的最適溫度為55 ℃，最適pH值為7.5，體現(xiàn)了其類胰蛋白酶的屬性。這一研究結(jié)果與Osnes[24]、Chen[25]等的結(jié)果相吻合。

2.2 南極磷蝦在自溶前后氨基酸態(tài)氮和游離氨基酸比例的變化

南極磷蝦在自溶酶最適溫度（55 ℃）和pH值（7.5）下自溶3 h，比較自溶前后氨基酸態(tài)氮和游離氨基酸比例的變化。南極磷蝦勻漿自溶前和自溶3 h后上清液中氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度分別為0.64 g/100 mL和0.69 g/100 mL。氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度反映氨基酸及小肽總體水平[26]，是反映醬油品質(zhì)的重要理化指標[27]，醬油氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度≥0.8 g/100 mL時為特級，0.7g/100 mL≤氨基酸態(tài)氮含量＜0.8 g/100 mL為一級[28]。由此可以得出南極磷蝦自溶前后上清液中的氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度已達到二級接近一級醬油的標準。

由表1可以看出，甘氨酸和脯氨酸為南極磷蝦的主要游離氨基酸，其次為谷氨酸和丙氨酸。南極磷蝦自溶后鮮味氨基酸如谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸質(zhì)量分數(shù)降低，而苦味氨基酸含量如亮氨酸、異亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸質(zhì)量分數(shù)升高。因此，在利用南極磷蝦自溶液制備調(diào)味品時應該慎重選擇自溶條件。

2.3 南極磷蝦自溶前后胰蛋白酶降解產(chǎn)物的變化

南極磷蝦自溶前后胰蛋白酶降解產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜-質(zhì)譜檢測，經(jīng)NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫檢索，得到了蛋白、肽段、分子質(zhì)量、保留時間、響應強度等信息。圖2為南極磷蝦自溶前后胰蛋白酶降解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布，為了提高可信度，僅顯示置信度大于95%以上的肽段。由圖2可以看出，與自溶前相比，南極磷蝦自溶后胰蛋白酶降解產(chǎn)物鑒定出的肽段條數(shù)明顯變少，小分子質(zhì)量的肽段比例明顯提高，說明南極磷蝦自溶酶對蛋白質(zhì)起到了酶切作用。

圖2 南極磷蝦自溶前后胰蛋白酶降解產(chǎn)物肽段的分子質(zhì)量分布Fig. 2 Molecular mass distribution of tryptic peptides from Antarctic krill with and without autolysis

南極磷蝦自溶前的胰蛋白酶降解產(chǎn)物中共鑒定到24 個蛋白、1 582 條肽段、5 169 個碎片，自溶后的胰蛋白降解產(chǎn)物中共鑒定到23 個蛋白、1 922 條肽段和5 890 個碎片。表2、3分別為在95%置信度下，南極磷蝦自溶前后胰蛋白酶降解產(chǎn)物中鑒定出的蛋白、肽段數(shù)目和95%置信度下的肽段覆蓋率。

表2 南極磷蝦自溶前胰蛋白酶降解產(chǎn)物鑒定的蛋白及肽段數(shù)目Table 2 Identification of proteins and peptides in tryptic hydrolysate of Antarctic krill without autolysis

表3 南極磷蝦自溶后胰蛋白酶降解產(chǎn)物鑒定的蛋白及肽段數(shù)目Table 3 Identification of proteins and peptides in tryptic hydrolysate of Antarctic krill with autolysis

為了區(qū)分南極磷蝦自溶前后胰蛋白酶降解產(chǎn)物，采用化學計量學進行分析。圖3為南極磷蝦自溶前后胰蛋白酶降解產(chǎn)物的OPLS-DA得分圖。從圖3中可以看出，自溶前和自溶后的南極磷蝦樣品沿X軸方向明顯分開，說明OPLS-DA得分圖可以很好地區(qū)分自溶前后的兩個樣品[29]。相比于自溶前的樣品，自溶后的樣品點略顯分散，但從總體上可以很好地區(qū)分兩個樣品。為了進一步尋找導致自溶前后的差異肽段，使用SMICA軟件的S-plot進行分析。

圖3 南極磷蝦自溶前后胰蛋白酶降解產(chǎn)物的OPLS-DA得分圖Fig. 3 Orthogonal partial least squares discriminant analysis score plot of tryptic hydrolysates of Antarctic krill with and without autolysis

圖4 南極磷蝦自溶前后胰蛋白酶降解產(chǎn)物的S-plot圖Fig. 4 S-plot of tryptic hydrolysates of Antarctic krill with and without autolysis

圖4 為OPLS-DA模型的S-plot圖，遠離原點，即“S”型兩端的點為導致兩個樣品差異的主要因素[30]。通過PeakView軟件對這些導致差異的點進行分析篩選，根據(jù)質(zhì)荷比m/z和保留時間提取峰，選取只在其中一個樣品中出現(xiàn)色譜峰的點，結(jié)果共鑒定到55 個點，其中26 個點來源于自溶前的樣品，29 個點來源于自溶后的樣品。由于南極磷蝦蛋白數(shù)據(jù)庫尚未完全，并非每個點都能匹配到肽段。將這55 個點的信息與數(shù)據(jù)庫檢索到的信息進行比對，共匹配到10 條肽段，其中5 條來源于自溶前的樣品，另外5 條來源于自溶后的樣品，詳細信息如表4所示。

表4 南極磷蝦自溶前后的差異性肽段Table 4 Differential peptides in tryptic hydrolysates of Antarctic krill with and without autolysis

3 結(jié) 論

本研究初步探索了南極磷蝦自溶酶的最適溫度和pH值，其最適溫度為55 ℃，最適pH值為7.5，具有類胰蛋白酶屬性。在南極磷蝦自溶酶最適溫度和pH值下對南極磷蝦自溶3 h，自溶后氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度升高，鮮味氨基酸如谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸質(zhì)量分數(shù)降低，而苦味氨基酸如亮氨酸、異亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸質(zhì)量分數(shù)升高；胰蛋白酶降解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布向小分子質(zhì)量范圍偏移，本實驗為研究南極磷蝦自溶技術(shù)提供了一定的參考。