文娜　胡運(yùn)蓮

[摘要] 目的 探討Lgr5、TFF2在萎縮性胃炎、低級別上皮內(nèi)瘤變中的表達(dá)及臨床意義。 方法 隨機(jī)選取2018年1～6月在湖北省中醫(yī)院病理科確診為萎縮性胃炎的胃鏡活檢蠟塊30例、低級別上皮內(nèi)瘤變的20例，采用免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測Lgr5、TFF2蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果 Lgr5、TFF2蛋白表達(dá)均為陽性，Lgr5在低級別上皮內(nèi)瘤變中的表達(dá)水平高于萎縮性胃炎，但兩組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;TFF2在低級別上皮內(nèi)瘤變中的表達(dá)水平低于萎縮性胃炎，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 Lgr5、TFF2的表達(dá)與胃癌前病變的病理嚴(yán)重程度相關(guān)，可作為潛在預(yù)測胃癌發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后的重要生物學(xué)標(biāo)記。

[關(guān)鍵詞] Lgr5;TFF2;萎縮性胃炎;低級別上皮內(nèi)瘤變;胃癌前病變

[中圖分類號] R573.3? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）12-0020-04

Expression and clinical significance of Lgr5 and TFF2 in atrophic gastritis and low-grade intraepithelial neoplasia

WEN Na1 HU Yunlian2

1.Hubei University of Traditional Chinese Medicine， Wuhan 430061， China; 2.Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine， Wuhan 430061， China

[Abstract] Objective To explore the expression and clinical significance of Lgr5 and TFF2 in atrophic gastritis and low-grade intraepithelial neoplasia. Methods Thirty gastroscopic biopsy waxes diagnosed as atrophic gastritis and 20 waxes of low-grade intraepithelial neoplasia treated in our hospital from January to June 2018 were randomly selected. Immunohistochemistry was used to detect the expression of Lgr5 and TFF2 proteins. Results The expression of Lgr5 and TFF2 protein were positive. The expression level of Lgr5 in low-grade intraepithelial neoplasia was higher than that in atrophic gastritis， but there was no significant difference between the two groups（P>0.05）. The expression level of TFF2 in low-grade intraepithelial neoplasia was lower than that in atrophic gastritis， and the difference was significant （P<0.05）. Conclusion The expression of Lgr5 and TFF2 is related to the pathological severity of gastric precancerous lesions， and can be used as an important biomarker for predicting the occurrence， development and prognosis of gastric cancer.

[Key words] Lgr5; TFF2; Atrophic gastritis; Low-grade intraepithelial neoplasia; Gastric precancerous lesions

胃癌是世界范圍內(nèi)高發(fā)病率、高死亡率的癌癥之一，盡管有先進(jìn)的診斷工具和治療方法，其5 年生存率仍低于30%[1]。腸型胃癌的發(fā)病是多因素、多步驟的病理過程，目前認(rèn)可的病理變化是：慢性淺表性胃炎→慢性萎縮性胃炎→腸上皮化生→上皮內(nèi)瘤變→腸型胃癌，其中萎縮性胃炎是癌前疾病，而腸化、上皮內(nèi)瘤變是癌前病變。近年來研究發(fā)現(xiàn)腫瘤可能起源于干細(xì)胞，胃腸道干細(xì)胞是存在于胃腸道組織中的成體干細(xì)胞，能分化形成各種胃腸道上皮細(xì)胞，目前可通過識別細(xì)胞表面標(biāo)志物如CD44、CD133、TFF2、Lgr5等方法研究胃癌及癌前狀態(tài)的相關(guān)分子表達(dá)水平。本次實(shí)驗(yàn)擬通過檢測Lgr5、TFF2在萎縮性胃炎、低級別上皮內(nèi)瘤變中的表達(dá)情況，來推測Lgr5、TFF2蛋白表達(dá)與胃癌發(fā)生的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

標(biāo)本來自病理科2018年1～6月湖北省中醫(yī)院病理科歸檔的蠟塊，隨機(jī)法從中選出病理診斷為萎縮性胃炎的病例30例，其中男16例，女14例，年齡25～68歲，平均（51.5±8.13）歲;低級別上皮內(nèi)瘤變病例20例，其中男10例，女10例，年齡24～73歲，平均（51.7±11.3）歲;每個指標(biāo)每例1張，共計50*2張，每例標(biāo)本均經(jīng)本院資深的病理醫(yī)師行病理學(xué)診斷，病理資料齊全。

1.2 方法與試劑

DAB濃縮型試劑盒、蘇木素、中性樹膠均購自bioswamp公司，Lgr5多克隆兔抗體（工作濃度1：25）、TFF2多克隆兔抗體（工作濃度1：40）均購自Abcam公司。Lgr5陽性信號定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，TFF2陽性信號定位在細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞核。

1.3主要儀器

OLYMPUS正置顯微鏡、移液器、恒溫烘箱、石蠟切片機(jī)、攤片機(jī)、IMS圖像分析系統(tǒng)。

1.4免疫組織化學(xué)染色

采用免疫組化SP法，抗原修復(fù)采用高壓熱修復(fù)。每組染色均以PBS代替一抗作為陰性對照，以已知的陽性組織作為陽性對照。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：4 μm厚的石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、0.01 M檸檬酸鈉緩沖溶液高壓修復(fù)、3% H2O2室溫孵育阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS緩沖液沖洗。滴加一抗，4℃冰箱過夜，滴加二抗室溫孵育，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片，光鏡下觀察結(jié)果。

1.5結(jié)果判定

由2位病理科醫(yī)師在未知臨床病理資料下讀取結(jié)果，并協(xié)商取得統(tǒng)一。判定方法參考黃江龍等[2]、江曉紅等[3]等采用的方法。Lgr5陽性定位為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，以細(xì)胞核為主，有棕褐色或棕黃色著色者為陽性，TFF2陽性定位為細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞核，以細(xì)胞核為主，有棕褐色或棕黃色著色者為陽性。先按染色強(qiáng)度計分，0分為無色，1分為淺黃色，2分為黃色，3分為深黃色;高倍鏡下隨機(jī)選取5個鏡野，計算500個細(xì)胞，按陽性細(xì)胞數(shù)占所計數(shù)的同類細(xì)胞數(shù)的比率，將結(jié)果分為4個等級，0級為陰性，計0分，1級為陽性細(xì)胞<20%，計1分，2級為陽性細(xì)胞20%～50%，計2分，3級為陽性細(xì)胞>50%，計3分;最后根據(jù)染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞比率等級的乘積分，為陰性0分（-），1～2分弱陽性（+），3～6分中度陽性（++），7～9分強(qiáng)陽性（+++）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件，用秩次表示Lgr5、TFF2蛋白在不同胃黏膜中表達(dá)強(qiáng)度，等級資料采用非參數(shù)Wilcoxon mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Lgr5、TFF2蛋白的表達(dá)與胃黏膜病變的關(guān)系

Lgr5的反應(yīng)物呈黃色或棕黃色，主要位于細(xì)胞核，萎縮性胃炎、低級別上皮內(nèi)瘤變中Lgr5的表達(dá)見封三圖1、2，兩者比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.49>0.05），見表1;TFF2的反應(yīng)物呈黃色或棕黃色，位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)，主要在細(xì)胞核，TFF2在萎縮性胃炎、低級別瘤變中的表達(dá)見封三圖3、4，兩者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.03<0.05）。見表2。

2.2 不同胃黏膜中Lgr5、TFF2蛋白的表達(dá)強(qiáng)度與性別、年齡的關(guān)系

萎縮性胃炎、低級別上皮內(nèi)瘤變中Lgr5、TFF2蛋白的表達(dá)與年齡、性別的關(guān)系比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表3～6。

3討論

富含亮氨酸重復(fù)序列的 G 蛋白偶聯(lián)受體5（Lgr5）是由18個富含亮氨酸的重復(fù)單位和 7個跨膜區(qū)域組成的G 蛋白偶聯(lián)受體，其分布廣泛，在大腦、脊髓、乳腺、毛囊、眼睛、生殖器官及胃腸道等均有表達(dá)[4-7]，已有研究發(fā)現(xiàn)Lgr5為Wnt信號通路的下游靶向基因，可作為胃、腸、毛囊等部位的干細(xì)胞標(biāo)記物[8];體內(nèi)的細(xì)胞譜系示蹤技術(shù)和體外培養(yǎng)系統(tǒng)研究[9]表明Lgr5+細(xì)胞是局限于胃竇腺體基底部的成體干細(xì)胞，是胃黏膜上皮更新的源泉，可維持正常數(shù)量的胃黏膜上皮細(xì)胞及腺體，提示Lgr5是胃多能干細(xì)胞的標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)在新生的胃中，Lgr5主要在胃體及幽門腺體底部表達(dá)，但在成熟的胃中，Lgr5局限于幽門腺體底部[9-10]。在病理狀態(tài)下，如淺表性胃炎、胃潰瘍、胃癌中Lgr5的表達(dá)部位分別是在黏液頸區(qū)域、管腔表面、腫瘤中央和侵襲部位前面[11];研究發(fā)現(xiàn)Lgr5與多種癌癥相關(guān)，如結(jié)直腸癌[12]、原發(fā)性肝癌[13]、胃腺癌[2]、子宮頸鱗狀細(xì)胞癌[14]。Xiu-Bin Li等[15]發(fā)現(xiàn)胃Lgr5+干細(xì)胞是致癌細(xì)胞，并可能作為癌癥傳播細(xì)胞，使之惡化。本研究發(fā)現(xiàn)Lgr5在萎縮性胃炎中主要表達(dá)于胃小凹及萎縮區(qū)域附近的腺體;在低級別上皮內(nèi)瘤變中主要表達(dá)于腺體底部，且腺腔基底側(cè)的染色強(qiáng)度高于腔面?zhèn)?，兩組比較，Lgr5在低級別上皮內(nèi)瘤變中的表達(dá)強(qiáng)度高于萎縮性胃炎，進(jìn)一步提示Lgr5有促進(jìn)胃黏膜病變加重的作用，可能是一種促進(jìn)炎癥發(fā)展的因子，但兩組比較無統(tǒng)計學(xué)意義，考慮此次樣本量較少，后續(xù)應(yīng)增加樣本量，進(jìn)一步研究Lgr5在不同胃黏膜中的表達(dá)情況。

TFF家族成員包括TFF1、TFF2、TFF3，是一種小肽分子，因其形狀類似三葉草，故稱為TFF，其中TFF2在胃、十二指腸特異性表達(dá)，具有減少胃酸分泌、與黏液蛋白結(jié)合形成保護(hù)屏障、促進(jìn)損傷組織修復(fù)的功能，從而起到保護(hù)胃黏膜的作用。生理情況下TFF2主要表達(dá)于胞質(zhì)，在胃黏膜上皮、表面黏液層、胃腺細(xì)胞和胃小凹中可見，病理情況下如消化性潰瘍、胃癌時，TFF2分別在胃潰瘍的基底部及邊緣，慢性萎縮性胃炎的黏膜表面、萎縮腺體及腸上皮化生的周圍表達(dá)增強(qiáng)[16]。當(dāng)損傷因子加重，或保護(hù)因子減少，則黏膜進(jìn)一步受損。周學(xué)文等[17]發(fā)現(xiàn) TFF2的表達(dá)在淺表性胃炎中低、在糜爛性胃炎中次低，在胃潰瘍中最低，病情輕重程度與TFF2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，說明TFF2可作為一種保護(hù)性因子。宋潔等[18]發(fā)現(xiàn)正常胃黏膜組織中 TFF2為陽性表達(dá)，表達(dá)率為100%，而在腸化生、異型增生以及胃癌組織中，其陽性表達(dá)率依次逐漸下降。

本次研究發(fā)現(xiàn)TFF2在萎縮性胃炎中主要表達(dá)于腺體底部，靠近萎縮區(qū)域;在低級別上皮內(nèi)瘤變中主要表達(dá)于腺體頸部，腺腔基底側(cè)的染色強(qiáng)度高于腔面?zhèn)?兩組比較，TFF2在萎縮性胃炎中的表達(dá)強(qiáng)度高于低級別上皮內(nèi)瘤變，且有統(tǒng)計學(xué)意義。此次研究提示TFF2可作為胃黏膜的保護(hù)因子，或許在胃黏膜病變時可給予外源性TFF因子以利于胃黏膜的修復(fù)。

綜上所述，通過本次研究發(fā)現(xiàn)Lgr5、TFF2在萎縮性胃炎、低級別上皮內(nèi)瘤變中的表達(dá)情況不同，一方面間接驗(yàn)證了Correa級聯(lián)學(xué)說的部分內(nèi)容;另一方面有助于臨床上更準(zhǔn)確的判斷癌前病變嚴(yán)重性及預(yù)后，也為研究治療腫瘤的靶向藥物提供了新的思路。但本次實(shí)驗(yàn)樣本量偏少，且因使用的是胃黏膜活檢蠟塊，取材淺，黏膜各層次無法全部展示，后續(xù)實(shí)驗(yàn)擬增加樣本量，或進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步明確Lgr5、TFF2在不同胃黏膜中的表達(dá)情況及其臨床意義。

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（收稿日期：2018-11-05）