盛慧,陳姍姍,艾聰聰,馮銳,張修國

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利用酵母雙雜交技術(shù)篩選卵菌效應(yīng)因子互作蛋白概述

盛慧,陳姍姍,艾聰聰,馮銳,張修國*

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院;山東省蔬菜病蟲生物學(xué)省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 泰安 271018

蛋白質(zhì)是生命活動的執(zhí)行者，其通過與DNA、RNA、蛋白質(zhì)、脂類以及多糖等物質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合體以參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、防衛(wèi)反應(yīng)等復(fù)雜的生命活動，因此研究蛋白質(zhì)之間相互作用可為揭示生命現(xiàn)象本質(zhì)提供依據(jù)。酵母雙雜交（Yeast two hybrid, Y2H）系統(tǒng)是篩選互作蛋白最常用的方法，它具快速、靈敏、簡便、高效、廣泛的優(yōu)點(diǎn)。卵菌是一類危害嚴(yán)重的植物病原菌，可分泌效應(yīng)因子，直接或間接與寄主體內(nèi)的蛋白發(fā)生作用從而促進(jìn)病原菌侵染與定植，引起寄主發(fā)病或者干擾、抑制寄主的抗病反應(yīng)，但目前對于病原卵菌效應(yīng)因子的寄主靶標(biāo)以及效應(yīng)因子增加寄主對病原菌的敏感性機(jī)制知之甚少，因此，利用酵母雙雜交技術(shù)篩選植物病原卵菌效應(yīng)因子互作蛋白，為探明其致病機(jī)制顯得尤為重要。

酵母雙雜交技術(shù); 互作蛋白; 卵菌; 效應(yīng)因子

生物信息學(xué)的發(fā)展極大地推動揭示了物種生命活動奧秘的進(jìn)程，各種生命活動時刻存在著核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子之間的相互作用。蛋白質(zhì)是生命活動的執(zhí)行者，其通過與DNA、RNA、蛋白質(zhì)、脂類以及多糖等物質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合體參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、防衛(wèi)反應(yīng)等復(fù)雜的生命活動，因此研究蛋白質(zhì)之間相互作用可為揭示生命本質(zhì)提供重要依據(jù)?；诜肿由飳W(xué)、生物化學(xué)、生物物理學(xué)等學(xué)科，已經(jīng)建立了多種研究蛋白質(zhì)互作的方法，包括酵母雙雜交、免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)、雙分子熒光互補(bǔ)（Bimolecular fluorescence complementation, BiFC）、pull-down等，其中在1989年，由Fields和Song創(chuàng)立的酵母雙雜交（Y2H）技術(shù)是研究蛋白質(zhì)相互作用最常用的方法。

本文將從酵母雙雜交技術(shù)的原理，酵母雙雜交技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)以及利用酵母雙雜交技術(shù)篩選互作蛋白應(yīng)用等方面進(jìn)行討論。

1 酵母雙雜交技術(shù)的原理

真核生物轉(zhuǎn)錄的起始需要反式作用因子的參與，許多反式作用因子往往是組件式的，由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA-binding domain，BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（transcription-activating domain，AD）組成。酵母雙雜交技術(shù)就是利用酵母反式作用因子的特性來進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用分析的系統(tǒng)[1,2]。其中釀酒酵母GAL4是最常用的反式作用因子。GAL4 BD與X蛋白融合表達(dá)構(gòu)成BD表達(dá)載體，GAL4 AD與Y蛋白融合表達(dá)構(gòu)成AD表達(dá)載體[3]，將這兩種載體同時轉(zhuǎn)化至經(jīng)改造的酵母菌株中。由于這種菌株在正常情況下不能合成亮氨酸（Leu）、色氨酸（Trp）、組氨酸（His)與腺嘌呤（Ade），因此無法在缺乏這些營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基上生長，只有當(dāng)X與Y發(fā)生相互作用時，BD和AD在空間上接近，使反式作用因子具有轉(zhuǎn)錄活性，激活下游報告基因HIS3、URA3、LACZ的表達(dá)[4]（圖1），從而通過功能互補(bǔ)和顯色反應(yīng)篩選到陽性菌落。

圖 1 酵母雙雜交技術(shù)原理[4]

DBD: DNA結(jié)合域; AD: 轉(zhuǎn)錄激活域; X: 誘餌蛋白; Y: 獵物蛋白; UAS: 上游激活序列

DBD: DNA binding domain; AD: activation domain; X: bait; Y: prey; UAS: upstream activating sequence.

2 酵母雙雜交技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)

作為研究蛋白相互作用的主要方法，酵母雙雜交系統(tǒng)的主要優(yōu)點(diǎn)是:（1）酵母雙雜交體系研究蛋白——蛋白相互作用的整個過程只對核酸進(jìn)行操作，充分利用了成熟的核酸技術(shù)和酵母這一快速方便的操作體系，使得實(shí)驗(yàn)簡單易行；（2）可直接從基因文庫中尋找編碼相互作用蛋白的DNA序列,而不需要分離純化蛋白；（3）可研究蛋白之間的弱相互作用。在細(xì)胞內(nèi)，弱相互作用與強(qiáng)相互作用一樣起著極其重要的生物學(xué)作用。免疫沉淀法以及近來發(fā)展起來，都要求蛋白——蛋白相互作用強(qiáng)度足夠大,而不能檢測蛋白之間的弱相互作用。酵母雙雜交體系中蛋白——蛋白相互作用發(fā)生在酵母細(xì)胞這一自然的狀態(tài)下，使得該方法的靈敏度很高。

酵母雙雜交技術(shù)具篩選效率高、可直接在核酸水平操作、接近植物細(xì)胞環(huán)境條件所編碼的外源蛋白能夠保持正確折疊方式等優(yōu)點(diǎn)，但依然存在其局限性，具體為：（1）假陽性較高，文庫蛋白含低親和力區(qū)域，可以和多種誘餌蛋白互作；許多獵物蛋白本身是轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的作用；目的蛋白能夠與啟動子區(qū)域進(jìn)行非特異性結(jié)合，從而啟動報告基因的轉(zhuǎn)錄；（2）并非能對所有蛋白質(zhì)間的相互作用進(jìn)行分析，各種酵母雙雜交系統(tǒng)均有其適用范圍，因此存在核表達(dá)體系和膜表達(dá)體系以適應(yīng)不同蛋白互作驗(yàn)證；（3）大量外源基因的表達(dá)可能影響酵母報告基因正常表達(dá)，存在假陰性。因此，蛋白質(zhì)間的相互作用還需其他方法加以驗(yàn)證提高其可靠性。

3 利用酵母雙雜交技術(shù)篩選卵菌效應(yīng)因子互作蛋白的研究進(jìn)展

卵菌是一類危害嚴(yán)重、廣泛分布的植物病原菌，給農(nóng)作物產(chǎn)量、社會經(jīng)濟(jì)以及自然生態(tài)系統(tǒng)造成了巨大威脅。它是多分支的群體，包括60多種疫霉菌、多個活體營養(yǎng)的霜霉菌和100多種腐霉菌,其中許多是植物病原菌。其中影響最大的是由致病疫霉（）引起的馬鈴薯晚疫病，1846年曾導(dǎo)致愛爾蘭饑饉，給歐洲大陸造成嚴(yán)重影響。其次影響較為嚴(yán)重的還有由大豆疫霉（）引起的大豆根莖腐病，由辣椒疫霉（）引起的辣椒疫病。研究發(fā)現(xiàn)卵菌可以分泌效應(yīng)因子，最重要的兩大類是RxLR效應(yīng)因子和CRN效應(yīng)因子。它們通過與寄主體內(nèi)的蛋白相互作用從而促進(jìn)病原物的侵染與定植，引起寄主發(fā)病或者是干擾、抑制寄主的抗病反應(yīng)，但目前對于病原物的效應(yīng)因子的靶標(biāo)和致病機(jī)制還缺乏相應(yīng)的研究，因此利用酵母雙雜交技術(shù)篩選效應(yīng)因子在寄主體內(nèi)的互作蛋白對于揭示其致病機(jī)制尤為重要。

3.1 利用酵母雙雜交技術(shù)篩選致病疫霉效應(yīng)因子互作蛋白的研究進(jìn)展

致病疫霉菌寄主范圍較窄，主要侵染茄科植物，馬鈴薯晚疫病和番茄疫病，給世界經(jīng)濟(jì)造成重大損失。作為研究最早、最為深入的一類效應(yīng)因子，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種致病疫霉效應(yīng)因子，通過酵母雙雜交技術(shù)篩選到其互作蛋白的方法也得到廣泛應(yīng)用。如Bos等通過此方法在馬鈴薯與致病疫霉互作的庫中篩選到了一個與AVR3a互作的E3泛素連接酶CMPG1,進(jìn)一步研究證明AVR3a是通過與CMPG1互作，鈍化和抑制其E3泛素連接酶活性，從而操縱植物正常蛋白降解系統(tǒng)[5]；Pi04089可以與馬鈴薯K-同源（KH）RNA結(jié)合蛋白StKRBP1發(fā)生相互作用促進(jìn)馬鈴薯晚疫病的發(fā)生[6]；Pi03192阻止兩種植物NAC轉(zhuǎn)錄因子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重新定位到細(xì)胞核從而促進(jìn)其侵染[7],；AVR2與植物磷酸酶BSU-LIKE PROTEIN1（BSL1）結(jié)合以介導(dǎo)疾病抗性[8]；AVR1與胞囊成分Sec5相互作用以操縱植物免疫[9]，Pi04314與三種宿主蛋白磷酸酶（PP1c）異構(gòu)體相互作用，使它們從核仁重新定位到核質(zhì)從而促進(jìn)晚疫病的發(fā)生[10]；PexRD2與宿主絲裂原活化蛋白激酶MAPKKKε相互作用以抑制植物免疫信號的傳導(dǎo)[11]。由此我們可以發(fā)現(xiàn)，致病疫霉的致病機(jī)制是錯綜復(fù)雜的，它可以產(chǎn)生多種效應(yīng)因子，與相關(guān)的酶或者轉(zhuǎn)錄因子等寄主體內(nèi)的蛋白發(fā)生相互作用，從而促進(jìn)其侵染，引起寄主植物發(fā)病，而酵母雙雜交技術(shù)作為篩選眾多效應(yīng)因子互作蛋白的第一步而發(fā)揮著尤為重要的作用。

3.2 利用酵母雙雜交技術(shù)篩選大豆疫霉菌效應(yīng)因子互作蛋白的研究進(jìn)展

大豆疫霉菌引起的大豆根莖腐病是大豆上極具毀滅性的病害之一，在大豆的整個生育期均可發(fā)生，每年給全球大豆生產(chǎn)造成的損失超過10億美元。生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)大豆疫霉基因組中RxLR效應(yīng)基因超過350個[12]，CRN效應(yīng)基因大概200多個，如此多的效應(yīng)因子如何操縱寄主植物促進(jìn)其侵染尚無定論。目前通過酵母雙雜交技術(shù)以及后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)PsAvr3c可有效結(jié)合并穩(wěn)定大豆富含絲氨酸/賴氨酸/精氨酸的蛋白質(zhì)GmSKRPs，重新編程宿主前mRNA剪接以破壞免疫[13]；CRN108與HSP（熱激蛋白）啟動子的保守元件HSE結(jié)合，從而干擾轉(zhuǎn)錄因子與后者的結(jié)合，從而抑制HSP基因家族的表達(dá)，干擾HSP介導(dǎo)的抗病信號通路[14]；Avr1k可以與植物細(xì)胞程序性死亡過程中的重要調(diào)控蛋白Pirin發(fā)生相互作用來抑制植物的PTI[15]；PsAvh94可以與MAPK信號級聯(lián)反應(yīng)途徑上的重要組分NbMKK1發(fā)生相互作用而阻斷植物MAPK信號通路，從而干擾寄主的防衛(wèi)反應(yīng)[16]；苯丙氨酸組氨酸解氨酶PAL是苯丙烷類代謝途徑中最重要的酶，其活性與植物抗病性有著密切的關(guān)系，Avh238與PAL互作來抑制植物的抗病反應(yīng)[17]；類似于AVR3a，Avrld也能夠和E3泛素連接酶發(fā)生互作來侵染寄主植物[18]。在寄主植物與大豆疫霉的長期競爭過程中，寄主植物進(jìn)化出多種識別病原物阻止其侵入機(jī)制，而大豆疫霉則分泌效應(yīng)因子，通過效應(yīng)因子與寄主植物體內(nèi)的相關(guān)蛋白發(fā)生作用，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)或者抑制植物的程序性細(xì)胞死亡來躲避寄主植物的識別，抑制植物防衛(wèi)反應(yīng)。

3.3 利用酵母雙雜交技術(shù)篩選辣椒疫霉菌效應(yīng)因子互作蛋白的研究進(jìn)展

辣椒疫霉菌引起的辣椒疫病是世界內(nèi)廣泛發(fā)生的毀滅性土傳病害，在短期內(nèi)即可暴發(fā)成災(zāi)，其寄主廣泛，主要侵染葉、果實(shí)和莖，引起軟腐、倒伏，可減產(chǎn)50％以上。以PcAvh1為誘餌蛋白通過酵母雙雜交從本氏煙cDNA文庫中篩選到PP2A-1和PP2A-2(蛋白磷酸酶2A的調(diào)節(jié)亞基及其同源異構(gòu)體)，經(jīng)后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)它們之間的互作抑制植物的程序性死亡[19]；PcAvr3a12靶向并抑制植物肽基-脯氨酰順反異構(gòu)酶抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的免疫[20]；PcRxLR207與RBPs互作，可能通過改變RBPs的定位來降低其活性從而導(dǎo)致植物生長異常，促進(jìn)辣椒疫霉的侵染[21]；在辣椒疫霉中與致病疫霉PiAvr3a相似的RXLR分泌蛋白PcAvr3a12可以靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位蛋白FKBP15-2來促進(jìn)其侵染[22]；葉廷躍等人通過酵母雙雜交技術(shù)篩選并驗(yàn)證了RxLR103能與EDS1、BAK1、BIK1、NPR3互作，RxLR172能與EDS1、SGT1b互作，RxLR48能與NPR1互作，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)[23]。與上述兩種卵菌相比，目前對于辣椒疫霉菌的研究相對較少，對其致病機(jī)制缺乏系統(tǒng)的了解，但上述一系列研究給我們提供了思路與依據(jù)，我們可以利用酵母雙雜交技術(shù)及后續(xù)研究篩選并研究其互作蛋白及致病機(jī)制。

4 展 望

本文闡述了酵母雙雜交技術(shù)的原理，利用酵母雙雜交技術(shù)篩選互作蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)以及研究進(jìn)展。近些年，隨著病原卵菌全基因組測序的接續(xù)完成和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷完善，依托基因組數(shù)據(jù)庫分析得到的與致病性相關(guān)的基因研究也不斷取得進(jìn)展。卵菌效應(yīng)因子的功能成為研究的焦點(diǎn)，通過研究發(fā)現(xiàn)，卵菌的致病機(jī)制是錯綜復(fù)雜的，它可以分泌多種效應(yīng)因子，與寄主植物的多種蛋白發(fā)生相互作用，促進(jìn)或者抑制各種信號途徑，這也正是其發(fā)病快，危害嚴(yán)重，難防難治的重要原因。目前對于致病疫霉與大豆疫霉的研究比較深入，但是對于辣椒疫霉以及其他疫霉還缺乏系統(tǒng)的研究，酵母雙雜交技術(shù)作為一種為研究蛋白質(zhì)相互作用的方法，雖然有一定的局限性，但是因?yàn)槠浜啽?、快速、高效的特點(diǎn)，在以后的研究中必將繼續(xù)發(fā)揮重要作用。

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A Review of Interaction Proteins of OomyceteEffectors Screened by Yeast Two Hybrid System

SHENG Hui, CHEN Shan-shan, AI Cong-cong, FENG Rui, ZHANG Xiu-guo*

271018,

Protein is the executor of life activities, which combines with DNA, RNA, proteins, lipids and polysaccharides to form complexes to participate in complex life activities such as signal transduction and defense reactions. Therefore, studying the interaction between proteins can provide a basis for revealing the nature of life phenomena. The yeast two-hybrid (Y2H) system is the most commonly method for screening interacting proteins, and it has the advantages of being fast, sensitive, simple, efficient and extensive. Oomycetes are a kind of serious plant pathogens, which can secrete effectors, promote the infestation and colonization of pathogens by interacting with proteins in the host, causing host disease or interference and inhibiting the host disease resistance response. However, little is known about the host target of pathogen effector and the mechanism by which the effector increases the host's sensitivity to pathogens. Therefore, it is particularly important to screen the ovarian effector interacting protein by yeast two-hybrid technique.

Yeast two hybrid system; interaction proteins; oomycetes; effectors

S961.5

A

1000-2324(2019)03-0357-04

10.3969/j.issn.1000-2324.2019.03.001

2018-08-23

2018-10-06

國家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-25-03B)

盛慧(1997-),女,碩士研究生,研究方向:植物病原真菌學(xué)和真菌資源利用. E-mail:15646700228@163.com

Author for correspondence.E-mail:zhxg@sdau.edu.cn