胡祖林 張源文 劉楊

【摘要】目的：觀察藍(lán)布正提取物對阿爾茨海默癥（AD）模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。方法：將54只KM小鼠隨機(jī)分為6組：正常對照組、模型對照組、陽性對照組、藍(lán)布正高、中、低劑量組。除正常對照組注射等體積生理鹽水外，其余各組小鼠每天皮下注射D-半乳糖聯(lián)合腹腔注射亞硝酸鈉復(fù)制AD模型小鼠。造模的同時灌胃相應(yīng)溶媒，除正常對照組和模型對照組灌胃等體積蒸餾水外，其余各組灌胃相應(yīng)藥物，連續(xù)60d。后行水迷宮檢測小鼠的逃避潛伏期和穿越平臺次數(shù)。水迷宮結(jié)束后，麻醉小鼠取腦組織，免疫組織化學(xué)法檢測腦組織TNF-α、AKT的表達(dá)。結(jié)果：與正常對照組比較，模型對照組逃避潛伏期明顯延長，穿越平臺的次數(shù)顯著減少，TNF-α、AKT的表達(dá)顯著增高;藍(lán)布正各劑量組較模型組上述指標(biāo)明顯改善。結(jié)論：藍(lán)布正對D-半乳糖聯(lián)合亞硝酸鈉復(fù)制的AD小鼠有改善作用，能下調(diào)炎癥因子的表達(dá)，增強(qiáng)老年癡呆小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

【關(guān)鍵詞】藍(lán)布正;老年癡呆;學(xué)習(xí)記憶能力;TNF-α;AKT

【中圖分類號】R285.5【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【文章編號】1007-8517（2019）1-0020-05

Abstract：ObjectiveToobservetheeffectofGeiHerbaextractonlearningandmemoryabilityandrelatedproteinexpressioninalzheimersdisease（AD）modelmice.Methods54KMmicewererandomlydividedinto6groups：Normalcontrolgroup，modelcontrolgroup，positivecontrolgroup，blueclothhigh，mediumandlowdosegroup.Inadditiontonormalcontrolgroup，othermiceineachgroupweresubcutaneouslyinjectedwithd-galactoseandintraperitoneallyinjectedwithsodiumnitritetoreplicateADmodelmice.Atthesametime，thecorrespondingsolventwaspouredintothestomach，exceptfordistilledwaterinthenormalcontrolgroupandthemodelcontrolgroup，thecorrespondingdrugwaspouredintothestomachinothergroupsfor60days.Thesubsequentwatermazewasusedtodetectthemicesescapelatencyandthenumberofcrossingplatforms.Afterthecompletionofwatermaze，braintissuewastakenfromanesthetizedmice，andtheexpressionofTNF-α，AKTwasdetectedbyimmunohistochemistry.ResultsComparedwiththenormalcontrolgroup，theescapelatencyperiodofthemodelcontrolgroupwassignificantlyprolonged，thenumberofcrossingtheplatformwassignificantlyreduced，andtheexpressionsofTNF-α，AKTweresignificantlyincreased.Comparedwiththemodelgroup，theaboveindexesweresignificantlyimprovedineachdosegroup.ConclusionGeiHerbahasanimprovedeffectond-galactosecombinedwithsodiumnitritereplicationinADmice，whichcandown-regulatetheexpressionofinflammatoryfactorsandenhancethelearningandmemoryabilityofseniledementiamice.

Keywords：GeiHerba;AlzheimersDisease;LearningandMemoryAbility;TNF-α;AKT

藍(lán)布正為薔薇科水楊梅屬植物柔毛路邊青GeumjaponicumThunb.var.chinenseBolle的干燥全草，在我國苗族地區(qū)民間常用來治療頭痛頭暈。2015年版《中國藥典》[1]記載，具有益氣養(yǎng)血的作用，臨床上常用于氣血虧虛。藍(lán)布正對大腦缺血缺氧具有改善作用，能有效緩解血虛導(dǎo)致的眩暈癥狀，有改善對大腦供血供氧及耐眩暈的作用[2]。研究表明藍(lán)布正對血管性癡呆大鼠的神經(jīng)細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用[3-4]，能改善血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[5]。

阿爾茨海默癥，是以無意識的記憶力緩慢下降為主要臨床表現(xiàn)的一種進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[6]。隨著我國老齡化人口的增長，阿爾茨海默癥的患病率逐年上升，據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，2010年中國的阿爾茨海默病患者數(shù)量已如中國的人口數(shù)躍居世界第一位，2015年世界阿爾茨海默癥報告顯示，到2050年全球老年癡呆患者從目前的4600萬人增長至1.315億人口[7]，并以低收入和中等收入國家發(fā)病率最為明顯[8]，而以拉丁美洲、中國、印度等國家的增長幅度最高，將超過300%[8]。阿爾茨海默癥已成為患者和家庭的沉重負(fù)擔(dān)，給家庭和國家?guī)沓林氐慕?jīng)濟(jì)壓力。防治藥物嚴(yán)重缺乏以及藥物副反應(yīng)已成為各國家治療該病的挑戰(zhàn)，以此為目標(biāo)的新藥研究旨在減輕家庭及社會的經(jīng)濟(jì)壓力。筆者前期的動物實驗研究結(jié)果觀察，藍(lán)布正在對血管癡呆的防治有一定的效果，以此來觀察是否對老年癡呆也有很好的治療作用。

1材料與方法

1.1動物SPF級KM雄性小鼠54只，體重約18～22g，購置重慶解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK（軍）2012-0011。

1.2藥品與試劑藍(lán)布正（采集貴州產(chǎn)藍(lán)布正，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院鑒定實驗室劉剛副教授鑒定為薔薇科水楊梅屬植物柔毛路邊青GeumjaponicumThunb.var.chinenseBolle），吡拉西坦片（批號：717H016，杭州民生藥業(yè)有限公司），D-半乳糖（批號：0902c052，BeiJingsolarbio），亞硝酸鈉（批號：170801，四川金山制藥有限公司），TNF-α（批號：ab34674，abcam公司），AKT抗體（批號：ab38449，abcam公司）。

1.3儀器Morris水迷宮（深圳瑞沃德生命科技有限公司），KD-BM型包埋機(jī)（浙江金華科迪有限公司），R-1010型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），RM2245型石蠟切片機(jī)（德國Leica公司），XSZ-HS3型顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠）。

1.4方法

1.4.1老年癡呆小鼠模型的制備適應(yīng)性喂養(yǎng)2天，將54只小鼠進(jìn)行Morris水迷宮篩選，去除先天愚笨，游泳耐力很差的小鼠。經(jīng)水迷宮篩選后所有小鼠合格，未見先天愚笨及耐力差的小鼠。將合格小鼠隨機(jī)分為6組，正常對照組（I組）、模型對照組（II）、陽性對照組（III）、藍(lán)布正高（IV）、中（V）、低（VI）劑量組。根據(jù)文獻(xiàn)[9-10]制備AD模型小鼠。除正常對照組注射等體積生理鹽水，其余各組皮下注射D-半乳糖聯(lián)合腹腔注射亞硝酸鈉，造模的同時給予灌胃相應(yīng)藥物，除正常和模型對照組灌胃等體積生理鹽水，其余各組灌胃相應(yīng)藥物，共60d。

1.4.2morris水迷宮檢測第61天進(jìn)行Morris水迷宮檢測，向Morris水迷宮內(nèi)灌水，水深剛好淹沒安全平臺1cm，水溫保持在（24±1）℃。整個水迷宮分為4個象限，每個象限設(shè)有一個不同的標(biāo)志物供學(xué)習(xí)記憶。每次訓(xùn)練時，從平臺所在象限的正對象限內(nèi)的任意地點(diǎn)將小鼠放進(jìn)池中，投放小鼠時，使小鼠面向池壁。小鼠從下水到找到安全平臺的時間為逃避潛伏期，設(shè)為90s，超過潛伏期未找到安全平臺者，則記為90s。下水前3天進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，每天2次，第4天正式測試其逃避潛伏期，第5天撤出安全平臺，觀察其穿越安全平臺的次數(shù)。

1.4.3免疫組化檢測Morris水迷宮完成的第2天，使用4%的水合氯醛0.1mL/10g麻醉小鼠后，摘取大腦，用4%的多聚甲醛固定后，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋、切片后進(jìn)行免疫組化檢測。通過4個視野的積分吸光度IA平均值來反映炎癥因子TNF-α、AKT的表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法全部數(shù)據(jù)分析采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，計量資料采用（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1Morris水迷宮結(jié)果與正常對照組比較，模型對照組逃避潛伏期明顯延長，穿越平臺次數(shù)減少（P<0.05）;與模型對照組比較，陽性對照組和用藥高、中劑量組逃避潛伏期顯著縮短，穿越平臺次數(shù)顯著增加（P<0.05）。各組小鼠游泳軌跡，與空白組相比，模型組小鼠游泳軌跡雜亂沒有秩序。見表1，如圖1所示。

2.2對腦組織海馬區(qū)TNF-α表達(dá)的影響TNF-α陽性顆粒呈棕黃色，主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。造模60天后，與正常對照組比較，模型對照組小鼠TNF-α表達(dá)顯著增高（P<0.01），神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，結(jié)構(gòu)欠清晰，表明D-半乳糖聯(lián)合亞硝酸鈉誘發(fā)小鼠腦組織炎癥損傷，成功建立了老年癡呆模型;與模型對照組比較，藍(lán)布正高劑量組TNF-α的表達(dá)顯著降低（P<0.05），表明高劑量藍(lán)布正提取物可提高抗炎癥損傷能力，改善小鼠腦組織損害狀況。見表2，如圖2所示。

2.3對腦組織海馬區(qū)AKT表達(dá)的影響AKT陽性顆粒呈棕色或棕黃色，主要在細(xì)胞漿中表達(dá)，與正常對照組比較，模型對照組小鼠AKT表達(dá)顯著增高（P<0.01），神經(jīng)細(xì)胞排列松散，表明D-半乳糖聯(lián)合亞硝酸鈉可造成腦組織缺血缺氧，誘發(fā)小鼠腦組織炎癥損傷，成功建立了老年癡呆模型;與模型對照組比較，陽性對照組、藍(lán)布正高、中、低劑量組AKT表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01，P<0.05），表明高、中、低劑量藍(lán)布正提取物可提高抗炎癥損傷能力，改善小鼠腦組織損害狀況。表2，如圖3所示。

3討論

腫瘤壞死因子（TNF）在消耗性疾病中起了重要作用，又稱惡液質(zhì)素。TNF-α的生物學(xué)活性占TNF總活性的70%～95%，目前常說的TNF多指TNF-α。在缺血缺氧性腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中炎癥細(xì)胞因子TNF-α起著重要作用[11]。動物實驗發(fā)現(xiàn)，腦組織在缺血缺氧病理生理過程中，存在多種炎癥因子的參與反應(yīng)，導(dǎo)致缺血缺氧時腦細(xì)胞的損傷和壞死，腦組織缺血缺氧同時又加快炎癥反應(yīng)，從而形成一個循環(huán)過程[12]。研究證實TNF-α在腦損傷后高度表達(dá)，并與腦組織病變的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[13]。TNF-α是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的分泌可引起其他炎癥因子如IL-6等的釋放，在機(jī)體炎癥啟動、維持和消退中起著重要作用[14]。該研究中觀察到，模型對照組小鼠腦組織中TNF-α明顯增加，出現(xiàn)學(xué)記憶能力下降。

AKT的產(chǎn)生與AD的發(fā)病有一定關(guān)系。AKT與腦缺血所產(chǎn)生的氧自由基、炎癥反應(yīng)等因素有關(guān)，并參與腦缺血的病理過程。AKT不但參與炎癥損傷還參與細(xì)胞凋亡。Girifn等[15]發(fā)現(xiàn)在AD患者腦內(nèi)AKT活性的升高及下游底物的磷酸化可能與AD疾病的發(fā)生有關(guān)。TNF-α通過PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路活化NF-κB，最終引發(fā)過度的組織炎癥反應(yīng)和損傷[16]。D-半乳糖聯(lián)合亞硝酸鈉能使小鼠大腦缺氧而發(fā)生炎癥反應(yīng)。實驗結(jié)果顯示，連續(xù)2個月的造模方法，成功建立了老年癡呆小鼠模型。從炎癥角度建立老年癡呆模型也在一定程度上順應(yīng)了有關(guān)學(xué)者提出的老年癡呆患者大腦中炎癥致病因素。前期實驗觀察藍(lán)布正能夠改善大鼠因大腦缺血而造成的學(xué)習(xí)記憶力障礙。有研究報告觀察藍(lán)布正在抗炎方面也體現(xiàn)了其較好的抗炎效果[17]。從本實驗觀察藍(lán)布正提取物能夠改善小鼠大腦缺血缺氧，下調(diào)炎癥因子的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)。

綜上，藍(lán)布正提取物可用于改善大腦缺血缺氧狀況，減輕炎癥反應(yīng)，但其具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究探討。

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（收稿日期：2018-11-13編輯：劉斌）