蔣丹丹，曹蘭鳳，許朝霞，李碩，董曉輝，姚芳*，張連珊,*

(1. 河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，石家莊 050017；2. 河北醫(yī)科大學(xué)新藥安全評(píng)價(jià)研究中心,石家莊 050017)

隨著飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣的改變，肥胖人群越來越多，研究顯示到2014年世界有6億人肥胖，肥胖率達(dá)13%[1]。肥胖不僅是一種非感染性流行病，而且是心腦血管疾病、癌癥、糖尿病等慢性病的重要誘因[2-4]?，F(xiàn)如今，肥胖成為基礎(chǔ)和臨床的研究熱點(diǎn)，仍有很多未知的領(lǐng)域需要研究探討，理想的動(dòng)物模型是疾病機(jī)制研究和藥物研發(fā)的基礎(chǔ)。目前常用的肥胖動(dòng)物模型主要是高脂飲食誘導(dǎo)[5]、自發(fā)性遺傳突變[6]和基因敲除小鼠[7]。2015年，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究所通過CRISPR/Cas9技術(shù)成功建立瘦素受體全基因敲除(Lepr-/-)大鼠[8]，本研究對(duì)此型大鼠的血脂血糖，胰島素功能及相關(guān)臟器的組織病理學(xué)進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，進(jìn)一步論證Lepr-/-大鼠作為代謝性疾病分子機(jī)制研究和新藥研發(fā)模型動(dòng)物的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

親代Lepr+/-大鼠，其瘦素受體(Leptinreceptor,Lepr)基因敲除雜合子(Sprague-Dawley背景)由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所張連峰教授贈(zèng)予【SCXK(京)2013-0002】，利用CRISPR/Cas9技術(shù)建立Lepr基因敲除(Lepr-/-)大鼠。動(dòng)物飼養(yǎng)于河北醫(yī)科大學(xué)GLP實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF環(huán)境【SYXK(冀)2018-005】，飼養(yǎng)條件：光照黑暗12 h循環(huán)，溫度20～25℃，濕度40%～70%，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。所有操作均符合動(dòng)物倫理學(xué)要求(倫理審批號(hào)：LACUC-Hebmu-PD-201718)。

1.1.2 主要試劑和儀器

DNA提取試劑盒(EE101-02, TransGen Biotech，中國(guó))；PCR MasterMix試劑盒(PC8001, Aidlab，中國(guó))；PCR引物(Invitrogen公司，美國(guó))；葡萄糖(Sigma公司，美國(guó))；胰島素(諾和靈，諾和諾德公司，丹麥)；游離脂肪酸檢測(cè)試劑盒(NEFA酶法，南京建成公司，中國(guó))；油紅O試劑(CO7961，北京Coolaber公司，中國(guó))；血糖儀(ACCU-CHEK，Performa，德國(guó))；全自動(dòng)血生化測(cè)定儀(CHEMIX-180，Sysmex公司，日本)，光學(xué)顯微鏡(Olympus BX63，日本)。

1.2 方法

1.2.1Lepr-/-大鼠的繁殖、鑒定及分組

采用雜合子×雜合子交配方式進(jìn)行繁殖培育(純合子動(dòng)物不孕不育)。子代大鼠出生8天后剪鼠尾提取DNA，PCR擴(kuò)增進(jìn)行基因型鑒定，野生型(Wild Type，WT)大鼠擴(kuò)增622 bp片段，純合子(Lepr-/-)大鼠擴(kuò)增368 bp片段，兩個(gè)片段引物序列如下：

Primer S：5’ CTTGTGTCCAGAGCCTTCCTATAAC

Primer AS：5’ ATTCCCCATGTTGTCTAGTAGTGATC

擴(kuò)增條件：95℃ 5 min；(95℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 45 s)×30；72℃ 10 min；hold 4℃。

離乳后大鼠根據(jù)基因鑒定結(jié)果分為模型組(Lepr-/-)和對(duì)照組(野生型)。兩組動(dòng)物均喂標(biāo)準(zhǔn)飼料，4周齡開始進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 監(jiān)測(cè)體重、攝食量和測(cè)定血糖

第4周開始監(jiān)測(cè)大鼠的攝食量/周和體重/周；每?jī)芍懿墒笪察o脈血測(cè)隨機(jī)血糖(RBG)和空腹血糖(FBG)。

1.2.3 葡萄糖耐量試驗(yàn)(GTT)和胰島素耐量試驗(yàn)(ITT)

在10周齡、14周齡和18周齡分別進(jìn)行GTT和ITT試驗(yàn)。

(1)GTT：大鼠禁食(不禁水)14 h，采鼠尾血測(cè)0 min血糖，按2 g/kg體重腹腔注射40%葡萄糖，于注射后15、30、60、90、120 min時(shí)間點(diǎn)采鼠尾靜脈血測(cè)定血糖。

(2)ITT：大鼠禁食(不禁水)4 h，采鼠尾血測(cè)0 min血糖，按0.75 U/kg體重腹腔注射胰島素(濃度0.375 U/mL)，于注射后15、30、60、90、120 min時(shí)間點(diǎn)采鼠尾靜脈血測(cè)定血糖。

1.2.4 測(cè)定血糖、血脂和血非酯化脂肪酸

10、14和18周齡大鼠禁食后取血，分離血清，于-20℃保存，統(tǒng)一測(cè)定。全自動(dòng)血生化測(cè)定儀檢測(cè)：血糖(GLU)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、總膽固醇(TCHO)、三酰甘油(TG)等指標(biāo)；采用南京建成游離脂肪酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血清非酯化脂肪酸(NEFA)濃度，根據(jù)說明書進(jìn)行操作。

1.2.5 病理組織學(xué)觀察

14周齡和18周齡模型組大鼠各10只，對(duì)照組大鼠各8只(雌雄各半)，禁食后3%戊巴比妥鈉麻醉(1.5 mL/kg體重)，腹主動(dòng)脈取血后，取心臟、腦、肝、腎稱重，計(jì)算臟腦系數(shù)(臟器重量/腦重)。心臟、肝、腎、胰腺、骨骼肌、內(nèi)臟脂肪、棕色脂肪等組織，常規(guī)福爾馬林固定、石蠟包埋、HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

腎小球直徑測(cè)量：每張腎臟HE切片于高倍鏡下選取20～25個(gè)帶血管極或(和)尿極的腎小球，每組共取100個(gè)腎小球，采用Image-Pro-Plus 5.0軟件計(jì)算腎小球的最大直徑。

1.2.6 油紅O染色。

4%多聚甲醛固定心臟、肝、腎、骨骼肌24 h，蔗糖梯度脫水，OCT包埋，冰凍切片(厚度6 μm)，油紅O染色。光學(xué)顯微鏡下觀察、照相。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Lepr-/-大鼠基因型鑒定結(jié)果

基因型結(jié)果分析：擴(kuò)增出622 bp條帶為WT大鼠；擴(kuò)增出368 bp條帶為L(zhǎng)epr-/-大鼠；同時(shí)擴(kuò)增出622 bp和368 bp兩個(gè)條帶為L(zhǎng)epr+/-大鼠，圖1所示。

注：Lepr-/-大鼠：3，6號(hào)；野生型大鼠：2，5，7，8號(hào)；雜合子大鼠：1，4號(hào)。圖1 子代大鼠基因型結(jié)果Note. Lepr-/- rats: 3, 6. Wild type rats: 2, 5, 7, 8. Heterozygous rats: 1, 4.Figure 1 Genotype of the offspring rats

2.2 Lepr-/-大鼠攝食量和體重明顯增加

雌雄性Lepr-/-大鼠4周開始出現(xiàn)攝食量增多和肥胖，持續(xù)到18周(圖2)。18周時(shí)，雄性Lepr-/-大鼠平均體重達(dá)(807.8 ± 100.0)g，是WT大鼠的1.5倍(P=0.003)；雌性Lepr-/-大鼠的平均體重達(dá)(645.5 ± 100.7)g，是WT大鼠的2.3倍(P< 0.001)(圖3A，C)；雄性Lepr-/-大鼠日平均攝食量達(dá)(48.9 ± 3.2)g，是WT大鼠的1.8倍(P< 0.001)，雌性Lepr-/-大鼠日平均攝食量達(dá)(33.4 ± 6.8)g，是WT大鼠的2.2倍(P< 0.001)(圖3B，D)。

圖2 14周Lepr-/-大鼠(左)與野生大鼠(右)對(duì)比圖Figure 2 14-week Lepr-/- rat (left) and wild type rat (right)

2.3 Lepr-/-大鼠隨機(jī)血糖升高和葡萄糖耐量受損

雌雄性Lepr-/-大鼠于10周出現(xiàn)隨機(jī)血糖波動(dòng)性升高，但個(gè)體間差異較大，持續(xù)到18周(圖4A，C)；雄性Lepr-/-大鼠空腹血糖與野生大鼠無顯著性差別，雌性Lepr-/-大鼠家腹血糖只在18周較野生型有意義增高(圖4B、D)。Lepr-/-大鼠于14周出現(xiàn)葡萄糖耐量受損：14周雄性Lepr-/-大鼠血糖峰值可達(dá)到20.0 mmol/L，葡萄糖刺激120 min后，血糖仍維持在較高水平(12.6 mmol/L)；18周受損加重：血糖峰值達(dá)29.4 mmol/L，刺激120 min后，血糖水平仍為21.2 mmol/L(圖5A)。雌性Lepr-/-大鼠14周血糖峰值達(dá)到23.0 mmol/L，刺激120 min后，血糖水平為16.5 mmol/L，比雄性糖耐量受損更明顯，18周受損程度和14周基本相同(圖5B)。

2.4 Lepr-/-大鼠表現(xiàn)胰島素抵抗

雌雄性Lepr-/-大鼠于10周出現(xiàn)胰島素抵抗，腹腔注射胰島素后血糖水平下降幅度小，且至刺激120 min后，血糖回升到較高水平；14周時(shí)胰島素抵抗加重(圖6)。

2.5 Lepr-/-大鼠血糖升高、血脂紊亂、血非酯化脂肪酸升高

兩種基因型的大鼠血生化指標(biāo)無性別差異，本研究將雌雄動(dòng)物血生化數(shù)據(jù)合并。結(jié)果顯示：10周血糖升高，14周和18周血糖有意義升高。10周的Lepr-/-大鼠血清總膽固醇、三酰甘油、非酯化脂肪酸、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白增高顯著，分別是野生型大鼠的1.5、8.7、2.7、1.5和1.8倍，血脂紊亂和血非酯化脂肪酸升高持續(xù)到18周(表1)。

2.6 Lepr-/-大鼠臟器重量增加

和同周齡野生大鼠比較，雄性14周Lepr-/-大鼠的心臟、肝臟和腎臟的凈重和臟腦系數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增高，并隨周齡的增加，心肝腎的臟器系數(shù)進(jìn)一步增加(表2)。雌性Lepr-/-大鼠臟器系數(shù)增大，同雄性一致(表3)。

注：(A、C)體重曲線；(B、D)攝食量曲線。Lepr-/-大鼠(雄性n=14，雌性n=13)；野生大鼠(雄性n=15，雌性n=13)。與野生型大鼠比較，**P< 0.01,***P< 0.001。圖3 Lepr-/- 大鼠和野生大鼠的體重和攝食量Note. (A, C) Curves of body weight. (B, D) Curves of daily food intake. Lepr-/- rats (male n=14, female n=13). WT rats (male n=15, female n=13). Compared with the wild type rats,**P< 0.01,***P< 0.001.Figure 3 Body weight and daily food intake of the Lepr-/- rats and wild type rats

注：(A、C)隨機(jī)血糖；(B、D)空腹血糖。Lepr-/-大鼠(雌雄各10只)；野生大鼠(雄性n=8，雌性n=10)。與野生型大鼠比較，*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001。圖4 Lepr-/- 大鼠和野生大鼠的隨機(jī)血糖和空腹血糖Note. (A, C) Curves of random blood glucose. (B, D) Curves of fasting blood glucose. Lepr-/- rats (male n=10, female n=10). WT rats (male n=8, female n=10). Compared with wild type rats,*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001.Figure 4 Random blood glucose and fasting blood glucose of the male and female Lepr-/- rats and wild type rats

注：10、14、18周齡大鼠腹腔給予葡萄糖后血糖值曲線。(A)雄性：Lepr-/-大鼠(10周n=9，14周n=8，18周n=5)；WT大鼠 (10周n=6，14周n=9，18周n=6)。(B)雌性：Lepr-/-大鼠(10周n=8，14周n=8，18周n=5)；WT大鼠(10周n=7，14周n=9，18周n=4)。與14、18周齡野生型大鼠比較，#，&P< 0.05,##，&&P< 0.01,###，&&&P< 0.001。圖5 葡萄糖耐量試驗(yàn)Note. Blood glucose levels were measured after D-glucose administration at 10,14 and 18 weeks. (A) male, Lepr-/- rats(10 weeks n=9, 14 weeks n=8, 18 weeks n=5). WT rats (10 weeks n=6, 14 weeks n=9, 18 weeks n=6). (B) female, Lepr-/-rats(10 weeks n=8, 14 weeks n=8, 18 weeks n=5). WT rats(10 weeks n=7, 14 weeks n=9, 18 weeks n=4). Compared with the wild type rats at 14 and 18 weeks respectively,#，&P< 0.05;##，&&P< 0.01;###，&&&P< 0.001.Figure 5 Glucose tolerance test in the male and female rats

注：10、14、18周齡Lepr-/-和野生大鼠腹腔給予胰島素后血糖數(shù)值曲線(雌性只檢測(cè)了10周和14周)。(A)雄性：Lepr-/-大鼠(10周n=9，14周n=5，18周n=5)；WT大鼠 (10周n=9，14周n=5，18周n=5)；(B)雌性： Lepr-/-大鼠(10周n=11，14周n=4)；WT大鼠(10周n=11，14周n=4)。與10、14、18周齡野生型大鼠比較，*，#，&P< 0.05,**，##，&&P< 0.01。圖6 胰島素耐量試驗(yàn)Note. Blood glucose levels were determined after insulin administration at 10, 14 and 18 weeks. (A) male, Lepr-/- rats (10 weeks n=9, 14 weeks n=5, 18 weeks n=5). WT rats (10 weeks n=9, 14 weeks n=5, 18 weeks n=5); (B) female, Lepr-/-rats (10 weeks n =11, 14 weeks n =4). WT rats(10 weeks n =11, 14 weeks n =4). Comparison with wild type rats at 10, 14 and 18 weeks respectively,*，#，&P< 0.05;**，##，&&P< 0.01.Figure 6 Insulin tolerance test in the male and female rats

周齡Age分組GroupsGLUTCHOTGHDL-CLDL-CNEFA10周WT5.33 ± 2.002.62 ± 0.490.64 ± 0.121.11 ± 0.300.32 ± 0.060.95 ± 0.26Lepr-/-8.89 ± 4.203.80 ± 0.96*5.54 ± 3.36**1.71 ± 0.55*0.59 ± 0.24 *2.60 ± 1.34*14周WT5.84 ± 1.632.18 ± 0.740.92 ± 0.311.18 ± 0.360.29 ± 0.091.10 ± 0.33Lepr-/-9.36 ± 2.44***3.84 ± 0.99***6.15 ± 5.15**2.03 ± 0.87 *0.44 ± 0.19*2.00 ± 0.78**18周WT6.09 ± 2.171.33 ± 0.530.56 ± 0.160.89 ± 0.400.18 ± 0.040.94 ± 0.31Lepr-/-10.97 ± 4.50 *3.92 ± 1.51**3.17 ± 2.39*2.24 ± 0.81**0.36 ± 0.08***1.17 ± 0.28

注：與野生型大鼠比較，*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001。

Note. Compared with the wild type rats,*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001.

表2 雄性大鼠的臟器系數(shù)(臟/腦比)Table 2 Organ coefficient (organ/brain ratio) of the male rats

注：與野生型大鼠比較，*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001。

Note. Compared with the wild type rats,*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001.

表3 雌性大鼠的臟器系數(shù)(臟/腦比)Table 3 Organ coefficient (organ/brain ratio) of the female rats

注：與野生型大鼠比較，*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001。

Note. Compared with the wild type rats,*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001.

2.7 Lepr-/-大鼠胰島增生、心肌細(xì)胞肥大、脂肪肝、肥胖相關(guān)性腎病和骨骼肌纖維內(nèi)脂質(zhì)沉積增多

14周Lepr-/-大鼠胰腺小葉間結(jié)締組織可見脂肪浸潤(rùn)，胰島面積增大，胰島內(nèi)毛細(xì)血管擴(kuò)張(圖7 A，D)；內(nèi)臟脂肪(圖7B，E)和棕色脂肪細(xì)胞直徑增大(圖7C，F(xiàn))；肝細(xì)胞彌漫性脂肪變性(圖7G，J)；腎小球細(xì)胞數(shù)目增多，毛細(xì)血管擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞可見核下空泡(圖7H，K)，Lepr-/-大鼠腎小球直徑(151.5 ± 19.2 μm)明顯大于野生對(duì)照組(130.43 ± 12.2 μm)(P<0.05)；心肌細(xì)胞肥大(圖7I，L)。油紅O染色結(jié)果：與野生大鼠肝細(xì)胞的細(xì)小脂滴比較，Lepr-/-大鼠肝細(xì)胞內(nèi)充滿大的脂滴；野生大鼠心臟，腎臟和骨骼肌實(shí)質(zhì)細(xì)胞未見脂滴沉積，Lepr-/-大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)未見明顯脂滴；部分腎近曲小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見脂滴沉積，部分骨骼肌纖維可見細(xì)小脂滴(圖8)。18周的各組織病理所見及各組織內(nèi)脂質(zhì)沉積與14周的基本相同。

注：A，B，C：野生大鼠的胰腺，內(nèi)臟脂肪，棕色脂肪(×20)；D，E，F(xiàn)：Lepr-/大鼠-的胰腺(→指示擴(kuò)張的毛細(xì)血管)，內(nèi)臟脂肪，棕色脂肪(×20)；G，H，I：野生大鼠的肝，腎,心臟(×40)；J，K，L：Lepr-/-大鼠的肝，腎(→指示核下空泡)，心臟(×40)。圖7 14周齡Lepr-/-大鼠和野生大鼠HE染色Note. (A, B, C) Pancreas, visceral adipose tissue, and brown adipose tissue of wild type rats. (D, E, F) Pancreas (Arrow indicates dilated capillaries), visceral adipose tissue, brown adipose tissue of Lepr-/- rats. (G, H, I) Liver, kidney, heart of wild type rats. (J, K, L) Liver, kidney (Arrow indicates vacuole inferior to nucleus), and heart of Lepr-/- rats.Figure 7 Pathological changes in the organs of Lepr-/-rats and wild type rats at 14 weeks of age(HE staining)

注：A，B，C，D：野生大鼠的心臟，肝，腎，骨骼??；E，F(xiàn)，G，H：Lepr-/-大鼠的心臟，肝，腎(▼指示脂滴)，骨骼肌。圖8 14周齡 Lepr-/-大鼠和野生大鼠油紅O染色Note. (A, B, C, D) Heart, liver, kidneys, and skeletal muscle of wild type rats. (E, F, G, H) Heart, liver, kidneys (▼indicates lipid droplet), and skeletal muscle of Lepr-/- rats.Figure 8 Lipid deposition in the organ tissues of the Lepr-/-rats and wild type rats at 14 weeks of age(Oil red O staining)

3 討論

隨著肥胖人群的增多，不僅心腦血管疾病、癌癥、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和糖尿病的發(fā)病率明顯上升，各種減肥藥物的研發(fā)未來也會(huì)有巨大市場(chǎng)前景，因此，穩(wěn)定的動(dòng)物模型無論對(duì)肥胖的機(jī)制研究還是藥物靶點(diǎn)的研發(fā)都非常重要。瘦素(leptin)是肥胖基因的產(chǎn)物，主要由白色脂肪分泌的蛋白質(zhì)類激素，通過和瘦素受體(leptin receptor，Lper)結(jié)合，參與糖、脂肪和能量的調(diào)節(jié)，維持?jǐn)z食和機(jī)體能量的平衡[9-10]。無論leptin缺失還是Lepr缺失，均會(huì)表現(xiàn)出肥胖伴不同程度糖尿病的表現(xiàn)。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)屬于第三代應(yīng)用人工核酸內(nèi)切酶制備基因定點(diǎn)突變及基因敲除動(dòng)物的技術(shù)，張連峰教授團(tuán)隊(duì)利用該技術(shù)制備了SD背景的Lepr敲除基因大鼠(Lepr-/-)，表型穩(wěn)定可以傳代[8]，且Lepr+/-大鼠的繁殖能力與SD大鼠基本相同。Lepr-/-肥胖大鼠模型屬國(guó)際首創(chuàng)。目前，db/db小鼠品系是應(yīng)用比較廣泛的肥胖癥和糖尿病動(dòng)物模型，但糖尿病的嚴(yán)重程度受基因背景的影響，BKS背景的有不可控制的高血糖，僅能存活10個(gè)月；B6背景的僅為一過性高血糖[6]。Zucker大鼠是Merck M(13 M品系)大鼠和Sherman大鼠的雜交品系，遺傳背景復(fù)雜，雖然有肥胖和高胰島素血癥，但隨機(jī)血糖和空腹血糖均正常[11]。本研究對(duì)普通飼料喂養(yǎng)的Lepr-/-大鼠進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)：1)10周齡出現(xiàn)葡萄糖耐量受損、胰島素抵抗和血脂異常，空腹血糖升高尚未達(dá)到糖尿病水平；2)14周齡大鼠的主要臟器發(fā)生病理改變：如胰島明顯增大、脂肪肝、肥胖性腎病、內(nèi)臟和皮下脂肪沉積明顯增多和棕色脂肪白脂化等。另外以SD大鼠為遺傳背景的動(dòng)物模型在生理、代謝、神經(jīng)系統(tǒng)等方面不僅比小鼠有更好的表現(xiàn)[12-13]，在實(shí)際應(yīng)用中還可以借鑒豐富的生理學(xué)數(shù)據(jù)。Lepr-/-大鼠作為代謝綜合征、肥胖性腎病[14]等疾病模型；也可進(jìn)行二次刺激，如喂以蛋氨酸-膽堿酯酶缺乏(MCD)的飼料，構(gòu)建非酒精性脂肪性肝炎(NASH)模型[15]，或干預(yù)構(gòu)建II型糖尿病模型等。綜上所述，Lepr基因敲除大鼠是肥胖和代謝綜合征等代謝性疾病的病因研究和藥理研究的理想且可靠的模型動(dòng)物。