楊先碧

自古以來，人類的好奇心不斷地推動著社會進步。在好奇心的驅(qū)使下，人類不僅把目光投向數(shù)萬光年之外的星空，也把視野推進到微納尺寸的微觀世界。對生命的細節(jié)看得越仔細，就越有利于人們知曉生命的本質(zhì)。正是在這樣的背景下，顯微技術(shù)成為熱門的科研領(lǐng)域，相關(guān)科學家也多次榮獲諾貝爾獎。瑞士科學家雅克·杜波謝、美國科學家阿希姆·弗蘭克、英國科學家理查德·亨德森，也因在冷凍顯微電鏡領(lǐng)域的突出貢獻，而分享了2017年諾貝爾化學獎。

顯微鏡放大微小樣品

如何看清微觀世界里的小東西？我們首先想到的就是使用顯微鏡。原始的光學顯微鏡是一個高倍率的放大鏡。據(jù)記載，在1610年前，意大利物理學家伽利略己制作過復式顯微鏡，并觀察了昆蟲的復眼。這是一種己具目鏡、物鏡和鏡簡等裝置，并被固定在支架上的顯微鏡。

1665年前后，英國生物學家胡克發(fā)明了比較類似我們現(xiàn)在學校實驗室里用的顯微鏡，并通過這臺顯微鏡看到了軟木中網(wǎng)格狀的結(jié)構(gòu)，胡克稱之為“細胞”。這是人類歷史上最偉大的發(fā)現(xiàn)之一，大大推動了生物學的發(fā)展。

與胡克同時代的荷蘭科學家列文虎克對顯微技術(shù)的推動做出了主要貢獻。他一生制作了不少于247架顯微鏡，觀察了許多細菌、原生動物和動植物組織，是第一個用顯微鏡做科學觀察的人。到18世紀，顯微鏡已有許多改進，應用比較普遍，已作為一種商品進行生產(chǎn)。

然而，傳統(tǒng)的光學顯微鏡不能無限制地放大微小的樣品，它會受到“阿貝原則”的限制。什么是“阿貝原則”？1873年，德國顯微鏡學家恩斯特·阿貝通過計算發(fā)現(xiàn)，由于光波相互干擾的原因，光學顯微鏡不能無限度地放大微小樣品，最多只能“看到”光波波長一半的樣品，即尺寸不小于200納米的樣品。這就是有名的“阿貝原則”，200納米也被稱為光學顯微鏡的“繞射極限”。

如何看清生物大分子

光學顯微鏡只能看到細胞或細胞內(nèi)較大的細胞器，要看到100納米以下的生物大分子就不太可能了。生物大分子是指生物體細胞內(nèi)存在的蛋白質(zhì)、核酸、多糖等大分子。每個生物大分子內(nèi)有幾千到幾十萬個原子，分子量從幾萬到幾百萬以上。生物大分子的結(jié)構(gòu)很復雜，但其基本的結(jié)構(gòu)單元并不復雜。蛋白質(zhì)分子是由氨基酸分子以一定的順序排列成的長鏈。氨基酸分子是大部分生命物質(zhì)的組成材料，不同的氨基酸分子有好幾十種。生物體內(nèi)的絕大多數(shù)酶就屬于蛋白質(zhì)，是生物體維持正常代謝功能所不可缺少的。

為了突破光學顯微鏡的局限，弄清楚生物大分子的構(gòu)造，科學家想了很多辦法。有的科學家制造出超高分辨率光學顯微鏡，其實是讓生物分子發(fā)熒光，這種方法的使用有一些局限性。因為它是用激光來激發(fā)生物大分子，這樣照射時間不能太長，否則可能殺死生物大分子。但是，照射時間短又可能會失去一些重要信息。而且，超高分辨率光學顯微鏡最高只能達到10納米的分辨率，仍然無法看清分子內(nèi)部的精細結(jié)構(gòu)。

還有一種很常用的方法是“x射線晶體衍射”技術(shù)。之前，亨德森就非常喜歡用這種技術(shù)來研究生物大分子。但是，這種技術(shù)也有很明顯的局限性，那就是這種方法需要首先獲取純度很高的生物大分子晶體。而不少生物大分子結(jié)晶情況不理想，甚至有的就不能結(jié)晶。膜蛋白就是一個很大的挑戰(zhàn)。對于大多數(shù)的生物，膜蛋白占了蛋白質(zhì)組的20%～30%，藥物靶點的達到40%以上。然而，這些分子的結(jié)構(gòu)很少能通過X射線晶體學來闡明。

科學家還想到的方法是用電子顯微鏡（簡稱電鏡）。電鏡的分辨率的確很高，可以達到納米級以下，看清生物大分子是沒啥問題了。電子的波長是光子波長的十萬分之一左右，就像一根極細的探針，理論上它打在蛋白質(zhì)分子等生物大分子身上能被反射，這些反射的電子就能產(chǎn)生一張照片，這就是電鏡的基本原理。這也是電鏡能比光學顯微鏡分辨率高得多的原因。

起初，電鏡是在材料科學領(lǐng)域中使用的，主要是用其高分辨率來解析材料的結(jié)構(gòu)。電鏡在材料科學上的應用遙遙領(lǐng)先于在生命科學上的應用。直到1947～1961年，生物學家才借鑒材料科學中的重金屬染色技術(shù)，利用電鏡技術(shù)觀測到了許多細胞亞顯微結(jié)構(gòu)，如葉綠體、線粒體、核糖體，等等。然而，電鏡的局限性也很明顯，那就是不能看到活生生的生物大分子。因為電鏡需要在高真空條件下工作，而生物樣品的含水量很高，水分的揮發(fā)使整個樣品無法保持真空。另外，電鏡的電子攜帶的能量很高，會把細胞“殘忍地燒死”。這樣一來，生物學家就難以研究分子在活細胞中的正?；顒?。

速凍凝固生命細節(jié)

為了讓電鏡也能看到活細胞內(nèi)的生物分子，科學家想了很多辦法。最終想到的辦法就是速凍。這就好比科幻小說中的冷凍休眠，把活人速凍之后，人體組織和細胞進入幾乎沒有活動的休眠狀態(tài)。多年以后，采用合理的方法解凍，人體又活過來了。也就是說，速凍的細胞雖然幾乎不能活動，但是它們的的確確具有生物活性。

在冷凍電鏡中，生物大分子被迅速冷凍，使得標本內(nèi)部和周圍的水被固定為玻璃態(tài)，以防止晶體的形成。玻璃態(tài)——一種看上去是固體，但其分子排列是無序的形態(tài)，所以是不折不扣的流體。為什么是玻璃態(tài)而不是冰（晶體）呢？首先，是為了保護生物大分子，凍成冰有可能讓生物大分子發(fā)生脫水，冰晶也容易傷害生物。其次，冰會衍射電子，從而降低電鏡觀察的圖像質(zhì)量。

利用電鏡向冷凍樣本發(fā)射電子束，被玻璃態(tài)速凍水包裹的生物大分子處于“休眠狀態(tài)”，不再怕電鏡的真空環(huán)境，也不怕高能電子來“燒”它。散射后的電子通過一個鏡頭形成二維且放大的圖像，并記錄在檢測器上。結(jié)合從各個角度拍攝的圖像并取這些角度的平均值，可以生成生物大分子結(jié)構(gòu)的3D模型。

最早發(fā)明冷凍電鏡的是亨德森，當時他用X射線晶體衍射技術(shù)研究膜蛋白遇到了困境，因為如上文所說，膜蛋白不能結(jié)晶。他用液氮冷凍的方法來保護視紫紅質(zhì)蛋白（一種膜蛋白）樣品不被電子束摧毀。終于在1975年，第一個非常粗糙的視紫紅質(zhì)蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)表了出來，圖片上可以看出七個跨膜蛋白鏈。

不過，亨德森所發(fā)明的速凍技術(shù)比較粗糙，獲得的圖像也非常模糊。速凍，聽起來好像是一件非常容易的事情，不就是快速冷卻么？然而，科學家探索了很久才找到合理的方法。1982年，杜波謝找到了一種快速冷凍的方法，使水分子還來不及變成排列整齊的冰晶就被凍成像玻璃一樣的物質(zhì)。

杜波謝發(fā)現(xiàn)，雖然水被冷凍之后極易形成冰晶，如六角形的晶體或者立方晶體，但當水被十分迅速地冷凍時（冷凍速度約2.6x105℃/秒），就不會形成晶體，而成為無定形的冰（即“玻璃態(tài)”）。將溶液中的生物大分子速凍在玻璃態(tài)的水中，就可以在液氮溫度下使用電鏡進行觀察。這奠定了冷凍電鏡制樣與觀察的基本技術(shù)手段，標志著冷凍電鏡技術(shù)的誕生。

不過，杜波謝的冷凍電鏡獲得的圖像的細節(jié)還不是很豐富，那些生物分子在照片中都是難以名狀的一團團的物體，這一領(lǐng)域的研究者也被戲稱為“難以名狀學家”（blobologist）。況且，電鏡獲得的都是二維圖像，難以確定生物大分子的三維結(jié)構(gòu)。

1986年，弗蘭克找到了合適的解決辦法。弗蘭克采用的方法是“同向拼圖”。他對同一種生物大分子不停地拍照，拍上數(shù)萬張甚至幾十萬張。聽起來似乎有些嚇人，但是對自動化的電鏡來說，并非難事。難點在于如何對這些照片進行后期處理。弗蘭克開發(fā)出一種識別和合成的軟件，可以將從數(shù)以萬計的照片中找到那些朝向相似的生物大分子挑選出來，然后再合成一張清晰的圖像，再把不同方向的清晰圖像合成起來，就可以得到生物大分子的三維結(jié)構(gòu)了。

我們以常見的CT舉個例子。如果醫(yī)生想看到患者腦組織的三維圖像，就需要用x射線從不同的方向掃描腦部，然后通過這些投影反推得到腦部的三維圖像。這與冷凍電鏡技術(shù)的三維重構(gòu)原理十分相似：如果樣品不具有任何對稱性，那么就需要沿著物體的不同方向進行投影，再通過反傅里葉變換得到物體的三維圖像。

弗蘭克發(fā)明的方法被學術(shù)界稱為“單粒子冷凍電鏡三維重建”技術(shù)。單粒子法就是對分離純化的顆粒狀分子進行結(jié)構(gòu)分析。既可以對有20面對稱結(jié)構(gòu)的病毒或螺旋對稱結(jié)構(gòu)進行分析，也可以對像核糖體等大的可溶性復合物進行結(jié)構(gòu)分析，還可以對溶解狀態(tài)的膜蛋白進行分析。

如今，超過90%的冷凍電鏡都應用這項技術(shù)來分析生物大分子。弗蘭克的軟件降低了圖片分析的門檻，讓這項技術(shù)擁有了普遍的應用價值。具有里程碑意義的成果是，2013年加州大學舊金山分校的程亦凡、大衛(wèi)·朱利葉斯等人首次得到膜蛋白TRPV1的近原子級別高分辨率三維結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)表在英國出版的《自然》雜志上。

冷凍電鏡的作用

理解生物大分子和大的復合物的反應機制是當今生物學領(lǐng)域里的一項重要目標。而冷凍電鏡可以很好地完成這項任務。冷凍電鏡的優(yōu)勢在于能夠在盡可能接近其天然形態(tài)的水合狀態(tài)下觀察大分子。這種在原子分辨率下捕獲生物分子的圖像和結(jié)構(gòu)的能力，將極大地幫助研究人員理解關(guān)鍵的生物過程，并建立結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)聯(lián)。

長期以來，由于對分子結(jié)構(gòu)的不了解，許多疾病沒辦法治療，而如今技術(shù)和發(fā)明日新月異，意味著我們在將來可以針對很多的疾病，研發(fā)出非常有效的藥。冷凍電鏡技術(shù)的進展聽上去很簡單：分辨率提高到0.35納米。然而，這意味著我們可以看見原子，看見化學變化的過程，看見原子如何排列成分子，看見病灶的組織結(jié)構(gòu)如何改變。未來，或許我們還將看見某種藥物可以阻止大腦衰老。

冷凍電鏡技術(shù)在幫助醫(yī)生了解細胞變化過程和發(fā)病機理上發(fā)揮了重要作用，并且有助于藥物開發(fā)。例如，在寨卡病毒的研究中，病毒結(jié)構(gòu)解析就起了重要作用。2016年以來，寨卡疫情引起了全世界的關(guān)注。這種由伊蚊傳播的病毒與出生缺陷以及神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫疾病存在關(guān)聯(lián)。冷凍電鏡成功地觀測到寨卡病毒的結(jié)構(gòu)，這是傳統(tǒng)電子顯微鏡無法做到的，也是這項新技術(shù)實際應用的一個很好的例子。

目前，冷凍電鏡分辨率已經(jīng)很高，可以獲得生物大分子的原子結(jié)構(gòu)。如今，科學家還在進一步努力提高冷凍電鏡的分辨率，以便揭示更多蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。從而更好地了解細胞變化過程、發(fā)病機理并開發(fā)治療手段。（責任編輯 張虹）