范藝巾，唐華均，劉 瑤，李成志

(重慶醫(yī)科大學生物醫(yī)學工程學院 省部共建國家重點實驗室培育基地—重慶市超聲醫(yī)學工程重點實驗室 重慶市生物醫(yī)學工程學重點實驗室 重慶市微無創(chuàng)醫(yī)學協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶 400016)

外陰鱗狀上皮內(nèi)病變是局限于外陰鱗狀上皮內(nèi)且有進展為浸潤癌潛在風險的癌前病變，也稱為外陰鱗狀上皮內(nèi)瘤變(vulvar squamous intraepithelial neoplasia， VIN)、外陰鮑恩病和原位癌，臨床多表現(xiàn)為外陰瘙癢、皮膚破損及潰瘍等[1]，2014年WHO女性生殖器腫瘤分類[2]將其分為低級別鱗狀上皮內(nèi)病變(low grade squamous intraepithelial lesion， LSIL)、高級別鱗狀上皮內(nèi)病變(high grade squamous intraepithelial lesion， HSIL)和分化型外陰上皮內(nèi)瘤變。近年外陰鱗狀上皮內(nèi)病變發(fā)病率逐年升高，且患者更趨于年輕化[1,3]。藥物治療、物理治療及外科手術是目前臨床治療外陰鱗狀上皮內(nèi)病變的主要方式，但治療后復發(fā)率仍為25%～50%，且患者對手術治療的依從性較差[4]。聚焦超聲治療具有治療時間短、術后恢復快、安全性高等優(yōu)點[5-6]，可安全、無創(chuàng)、有效地治療129/J型外陰上皮內(nèi)瘤變模型小鼠[7-8]。 Jia等[9]采用聚焦超聲治療HSIL后6個月，89%患者癥狀緩解，組織病理學表現(xiàn)基本恢復正常，無進展為外陰浸潤癌者。本研究建立大鼠外陰LSIL模型，探討聚焦超聲治療對模型大鼠外陰皮膚中缺氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor-1α， HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)及突變型p53(mutant type p53， mtp53)表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物模型建立 選取6～8周齡SPF級雌性SD大鼠28只[由重慶醫(yī)科大學動物實驗中心提供，許可證號:SYXK(渝)2017-0023]，體質(zhì)量160～180 g，平均(170.30±7.16)g。參考本課題組前期研究[10]方法，通過機械刺激聯(lián)合0.5%二甲基苯并蒽(7,12-dimethylbenzanthracene, DMBA)丙酮溶液涂抹，于每周固定時間進行實驗處理，共14周，建立SD大鼠外陰LSIL模型。將28只模型大鼠隨機分為治療組和對照組，每組各14只。

1.2 聚焦超聲治療 對治療組大鼠以0.6%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉后保定于操作臺，常規(guī)備皮、涂抹超聲耦合劑。采用海極星CZF型超聲波婦科治療儀，以5～10 mm/s恒定速度連續(xù)直線輻照，輻照區(qū)域包括外陰病變區(qū)及其周圍組織5 mm范圍內(nèi)區(qū)域，頻率10.20 MHz,功率2.5 W，焦距3.5 mm。輻照過程中采用泰仕TES-1310測溫儀監(jiān)測表皮溫度，達40℃時則停止輻照[7]。對照組大鼠給予超聲假輻照，治療儀無功率輸出。

1.3 組織病理學觀察 分別于模型建立后及聚焦超聲治療后4周，以直徑3 mm的皮膚鉆環(huán)取大鼠外陰皮膚，置于4%多聚甲醛中固定，經(jīng)再脫水、石蠟包埋、切片、HE染色后，采用Olympus BX40型光學顯微鏡觀察組織病理學變化。

1.4 免疫組織化學檢測 聚焦超聲治療后4周，另取大鼠外陰皮膚，制備石蠟塊切片，脫蠟及脫水后，行抗原修復。在室溫避光條件下，于3%雙氧水溶液中孵育25 min，滴加3%牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)200 μl，室溫封閉30 min；加入用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline， PBS)配制好的一抗，HIF-1α、VEGF、mtp53抗體工作濃度分別為1∶400、1∶1 000、1∶100，以PBS漂洗后，再滴加50 μl與一抗相應種屬的二抗，最后滴加100 μl二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine, DAB)顯色液進行顯色，并脫水封片，分別用于HIF-1α、VEGF及mtp53檢測。采用Olympus BX40型光學顯微鏡進行觀察并采集圖像，通過IPP 6.0軟件進行光密度分析；在高倍(×400)鏡下從每張切片中隨機選取5個高倍視野，計算平均光密度值，代表蛋白的相對表達強度。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件。計量資料以±s表示，采用獨立樣本t檢驗比較2組間HIF-1α、VEGF及mtp53表達的差異；計數(shù)資料以百分率表示，采用χ2檢驗比較2組大鼠外陰組織病理結果的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

實驗處理14周后，2組模型大鼠外陰皮膚組織病理學檢查均出現(xiàn)LSIL病理改變，證實模型建立成功，見圖1。

2.1 聚焦超聲治療后大鼠外陰組織病理學變化 超聲輻照/假輻照后4周，治療組13只(13/14，92.86%)大鼠外陰皮膚基本恢復正常結構(圖2A)，1只(1/14，7.14%)仍表現(xiàn)為LSIL；對照組4只(4/14，28.57%)大鼠仍表現(xiàn)為LSIL，10只(10/14，71.43%)進展為HSIL(圖2B)。2組間外陰皮膚組織病理結果差異有統(tǒng)計學意義(χ2=24.80，P<0.001)。

2.2 聚焦超聲治療后大鼠外陰皮膚中HIF-1α、VEGF及mtp53表達 HIF-1α和VEGF的表達位于細胞質(zhì)和細胞膜，mtp53的表達位于細胞核，治療組染色較淺而對照組顏色較深，見圖3。超聲輻照/假輻照后4周，治療組大鼠外陰皮膚中HIF-1α、VEGF及mtp53表達與對照組相比均明顯減低(P均<0.001)，見表1。

表1 免疫組織化學檢測2組外陰LSIL模型大鼠外陰皮膚中HIF-1α、VEGF及mtp53表達(平均光密度值，×10-2，±s，n=14)

表1 免疫組織化學檢測2組外陰LSIL模型大鼠外陰皮膚中HIF-1α、VEGF及mtp53表達(平均光密度值，×10-2，±s，n=14)

組別HIF-1αVEGFmtp53治療組0.04±0.011.29±0.080.03±0.02對照組1.12±0.233.15±0.690.93±0.15t值11.236.5513.66P值<0.001<0.001<0.001

3 討論

聚焦超聲治療是一種新興的非侵入性局部治療技術，現(xiàn)已廣泛用于治療多種腫瘤及非腫瘤性疾病[11-14]。其原理是體外發(fā)射低能量超聲波，使之透過表層組織聚焦于特定靶區(qū)，在通過熱效應、機械效應和空化效應等導致病變組織變性、壞死的同時，保持局部解剖結構的完整性[11]。Wu等[15]報道，聚焦超聲治療外陰上皮內(nèi)非瘤樣病變的總有效率達93.38%，且無嚴重并發(fā)癥發(fā)生。Jia等[8]采用聚焦超聲治療129/J型VIN模型小鼠，治療后2個月總有效率為100%(35/35)。本研究建立外陰鱗狀上皮內(nèi)病變大鼠模型，發(fā)現(xiàn)聚焦超聲治療后4周92.86%(13/14)的治療組模型大鼠外陰皮膚基本恢復正常組織結構；而對照組大鼠中，28.57%(4/14)仍表現(xiàn)為LSIL，71.43%(10/14)進展為HSIL；表明聚焦超聲治療外陰LSIL安全、有效，聚焦超聲有助于阻止甚至逆轉(zhuǎn)LSIL向HSIL發(fā)展。

低氧是實體腫瘤及炎癥性疾病組織微環(huán)境中的病理生理特征之一。HIF-1α是在低氧條件下調(diào)控氧平衡的主要轉(zhuǎn)錄因子，在人及哺乳動物細胞內(nèi)廣泛存在。在正常生理狀態(tài)下，細胞中HIF-1α蛋白極少；但當細胞處于持續(xù)缺氧狀態(tài)時，降解HIF-1α的泛素化途徑被阻斷，蛋白表達量明顯增加且蛋白穩(wěn)定性增強；且HIF-1α可直接激活VEGF、促紅細胞生成素和胰島素樣生長因子等下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達，從而調(diào)控血管新生、細胞增殖及生存、能量代謝、腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移等，這一系列生物學效應對細胞自身調(diào)節(jié)、腫瘤微血管形成及癌前病變的發(fā)生具有重要意義[16]。HIF-1α在膀胱癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、肺癌、食管癌、口咽癌和皮膚癌等多種腫瘤均呈高表達，某些癌前病變也存在HIF-1α高表達[17]。杜善平等[18]研究發(fā)現(xiàn)，正常外陰組織中HIF-1α蛋白幾乎無表達，而在VIN中HIF-1α表達升高。本研究結果顯示，治療組大鼠外陰皮膚中HIF-1α表達較對照組明顯降低，提示聚焦超聲治療可通過下調(diào)HIF-1α表達而改善局部組織氧平衡狀態(tài)。

圖1 外陰LSIL模型大鼠外陰皮膚組織病理圖 鱗狀上皮增厚，上皮下半部細胞密度增加，極性輕度紊亂、大小不等，輕度異形性，可見核分裂象(HE，×100) 圖2 超聲輻照/假輻照后外陰LSIL模型大鼠外陰皮膚組織病理學變化(HE，×100) A.治療組大鼠超聲輻照后4周外陰皮膚基本恢復正常； B.對照組大鼠超聲假輻照后4周進展為HSIL，可見異常角化珠(箭)

圖3 超聲輻照后4周外陰LSIL模型大鼠外陰皮膚中HIF-1α、VEGF及mtp53表達情況(×400) A、B.對照組大鼠HIF-1α染色較深(A，黑箭)，治療組大鼠HIF-1α染色較淺(B，白箭)； C、D.對照組VEGF染色較深(C，黑箭)，治療組大鼠VEGF染色較淺(D，白箭)； E、F.對照組mtp53染色深(E，黑箭)，治療組mtp53染色較淺(F，白箭)

VEGF是調(diào)節(jié)血管生成的主要因子，受多種細胞因子調(diào)控；高表達的HIF-1α蛋白可大量激活VEGF轉(zhuǎn)錄，從而促使局部組織新生血管形成。VEGF通過與VEGF受體1/FAM 樣酪氨酸激酶1和VEGF受體2 /胎肝激酶1特異性結合，激活并誘導血管內(nèi)皮細胞進行有絲分裂，從而增殖產(chǎn)生大量血管內(nèi)皮細胞[19]。Li等[20]研究報道，VEGF在正常人外陰表皮內(nèi)少部分區(qū)域呈弱陽性表達，而在VIN患者外陰表皮內(nèi)大部分區(qū)域呈強陽性表達。本研究結果顯示，與對照組比較，治療組大鼠外陰皮膚中VEGF表達明顯降低，提示聚焦超聲治療可減弱VEGF表達，從而在一定程度上減少LSIL局部新生血管形成。

p53基因被認為是人類基因組的“守護者”，其中野生型p53基因具有較強的抑癌功能，而mtp53基因不但喪失了抑癌功能，還可通過激活下游各類靶基因解除對細胞周期的調(diào)控，促進細胞增殖并提高細胞存活率，從而促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[21]。侯學濤等[22]研究報道，正常外陰組織發(fā)生外陰鱗狀上皮內(nèi)病變至進展為外陰鱗狀細胞癌過程中，mtp53蛋白陽性表達率逐漸升高；表明mtp53與外陰鱗狀上皮內(nèi)病變的發(fā)生有關，檢測mtp53表達有助于早期診斷外陰惡性病變。本研究結果顯示，治療組大鼠外陰皮膚中mtp53表達較對照組明顯降低。

總之，聚焦超聲治療大鼠外陰LSIL安全、有效，超聲輻照后大鼠外陰皮膚中HIF-1α、VEGF及mtp53表達降低可能為其作用機制。