劉媛媛，劉 陶，吳玉梅，張 晗，趙 鑫，劉志東，李 楠

(天津中醫(yī)藥大學1. 現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術教育部工程中心、2. 天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，天津 301617)

隨著環(huán)境的日益惡化以及大氣層的不斷破壞，輻射地球的紫外線(ultraviolet rays，UV)強度越來越大。皮膚長期暴露于紫外線下導致皮膚老化，大量實驗研究表明，氧化應激是UV造成皮膚損傷的重要原因。當皮膚受到UV輻射時，皮膚內形成大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)。正常情況下，體內ROS的產生和清除處于動態(tài)平衡，UV反復照射破壞了氧化和抗氧化防御系統(tǒng)平衡[1]。高水平的ROS等氧化物可引起表皮角質層和真皮層內細胞脂質、核酸、蛋白質等大分子損傷，影響相關信號通路傳導。

轉錄因子NF-E2相關因子2(NF-E2-related factor 2，Nrf2)是調控細胞對抗外源性有害物質和氧化損傷的關鍵轉錄因子。Nrf2通過與抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)相互作用，誘導抗氧化蛋白表達。Nrf2-ARE是機體抵抗內外界氧化損傷的防御性轉導通路[2-3]。正常生理情況下，細胞質中的Nrf2與Keap1結合，并處于活性相對抑制狀態(tài)。在應激狀態(tài)下，Nrf2與Keap1解離轉位至細胞核，啟動下游超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等基因和蛋白表達，從而維持機體氧化還原平衡。Nrf2-ARE通過抑制ROS，從而阻止光老化的形成。

黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)是唇形科黃芩屬多年生草本植物，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血等功效。黃芩的活性成分主要是黃酮類，包括漢黃芩素、黃芩素、黃芩苷等。漢黃芩素、黃芩素、黃芩苷均具有抗氧化、抗衰老的作用[4]。植物雌激素通過調節(jié)雌激素受體，促進細胞中核轉錄因子Nrf2入核[5-9]，從而發(fā)揮抗氧化抗衰老作用[2，10-12]。漢黃芩素、黃芩素、黃芩苷均為黃芩中植物雌激素類成分[12-13]，它們是否能通過雌激素受體調節(jié)Nrf2-ARE信號通路，發(fā)揮抗氧化作用還有待明確。本研究通過建立基于Nrf2-ARE通路的報告基因篩選模型，篩選黃芩中基于雌激素受體發(fā)揮抗氧化作用的活性成分，并利用UVB造模后的HaCaT細胞進行驗證。

1 材料

1.1 儀器FORMA3111 CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；低溫高速離心機(美國Beckman)；HZQ-C空氣浴振蕩器(哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠)；超凈臺(蘇州佳寶凈化工程有限公司)；SH2B型紫外光療儀(美國Sigma)；DMIL倒置相差顯微鏡(德國LEICA)；Infinite M200型多功能酶標儀(瑞士Tecan)；VICTORTMX5多功能讀板儀(Perkin Elmer)；Flex Station3多功能酶標儀(美國Molecula Device)。

1.2 藥物與試劑叔丁基對苯二酚(tertiary butylhydroquinone，tBHQ，Sigma)；ICI 182780(Biotechne，批號：129453618)；全反式維甲酸ATRA(Solarbio，批號：1228A023)；ROS試劑盒、SOD測試盒(WST-8法)，均購自碧云天；SOD測試盒(WST-1法)，購自南京建成生物工程研究所；漢黃芩素(wogonin，批號：C19A8Q34235)、黃芩素(baicalein，批號：C20M8Y31962)、黃芩苷(baicalin，批號：P16S8F44143)，購自上海源葉生物科技有限公司。DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清(Biological Industries)；DMSO(Sigma)；CCK-8試劑盒(日本Dojindo Lab)；感受態(tài)細胞DH5α、質粒小提試劑盒(天根)；螢火蟲熒光素酶報告基因載體pGL4.37、海腎熒光素酶報告基因載體pRL-TK(Promega)；氨芐西林、LB液體培養(yǎng)基(干粉)、LB固體培養(yǎng)基(干粉)，購自Solarbio。

1.3 細胞株人腎上皮細胞系293T、人類永生化表皮細胞株HaCaT，來源為ATCC細胞庫。

2 方法

2.1 質粒載體的轉化與驗證利用感受態(tài)細胞DH5α轉化質粒pGL4.37，并加入到適量菌湯中，用無菌的涂布器取適量菌湯涂布于選擇培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)，37 ℃過夜。挑取單個菌粒，加入到含有適量肉湯的錐形瓶中，37 ℃、160 r·min-1過夜搖菌。從過夜搖菌的菌液中取1 mL于離心管中，做好標記。通過設計上游引物①：5′-GTGAATCGATAGTACTAACA-3′；上游引物②：5′-TCAACGAGTACGACTTCGTG-3′；下游引物①：5′-CCAAACTCATCAATGTATCT-3′三段引物，將質粒送華大基因公司測序，以進一步鑒定陽性克隆[5]。

2.2 質粒的提取及測定取“2.1”中陽性克隆的菌液，采用質粒小提試劑盒提取質粒。取1 μL質粒溶液，以DEPC水作空白對照。在紫外分光光度計上分別讀取260 nm、280 nm波長下的吸光度值。

2.3 細胞培養(yǎng)復蘇293T細胞，以10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.5 293T細胞瞬時共轉染及ARE轉錄活性的測定取對數(shù)生長期的293T細胞，以3×104個/孔的密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞生長密度達到70%～80%時，使用PEI(1 g·L-1)轉染試劑同時轉染ARE熒光素酶報告質粒pGL4.37(每孔41 ng)和海腎熒光素酶報告質粒pRL-TK(每孔2.4 ng)，培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結束后，各孔分別加入Nrf2激活劑tBHQ(10 μmol·L-1)，不同濃度的黃芩苷、漢黃芩素、黃芩素和細胞基礎培養(yǎng)基，培養(yǎng)6 h。棄上清液，D-Hank′s漂洗細胞，裂解后，用Dual-Luciferase檢測系統(tǒng)檢測。每組實驗設6個復孔，重復3次。通過螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性對比，得到相對熒光素酶活性值。誘導表達倍數(shù)=(藥物誘導的Luciferase/藥物誘導的Renilla)/(基培對照組的Luciferase/基培對照組的Renilla)。

2.6 黃芩主要活性成分通過雌激素受體影響Nrf2-ARE通路發(fā)揮抗氧化作用預先給予濃度為1 μmol·L-1的雌激素受體抑制劑ICI 182780稀釋液50 μL處理細胞1 h，再分別加入200 μmol·L-1的黃芩苷溶液50 μL，使黃芩苷最終濃度為100 μmol·L-1，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，檢測熒光，方法同“2.5”。

2.7 驗證黃芩中主要活性成分的抗氧化作用

2.7.1細胞模型的建立 復蘇HaCaT細胞，以10%胎牛血清的MEM完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長到80%左右進行種板。抑制劑組預先給予濃度為1 μmol·L-1的雌激素受體抑制劑ICI 182780稀釋液和1 μmol·L-1Nrf2-ARE通路抑制劑ATRA[14]稀釋液各50 μL處理HaCaT細胞1 h，再分別加入200 μmol·L-1的黃芩苷溶液50 μL，使黃芩苷最終濃度為100 μmol·L-1，給藥組直接給予100 μmol·L-1的黃芩苷溶液100 μL，加入繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，造模。將預給藥后的HaCaT細胞分別給予不同劑量的UV照射，設置空白對照組，24 h后分別收集細胞，檢測細胞活性。光源采用美國Sigma公司的SH2B型紫外光療儀，模擬UVB輻射皮膚損傷模型，光譜為280～320 nm，強度為60 mJ·cm-2。

2.7.2UVB照射后HaCaT細胞ROS、SOD活性的檢測 使用ROS試劑盒考察空白組、模型組、給藥組、抑制劑組的HaCaT細胞ROS活性。用無血清MEM培養(yǎng)基清洗細胞，每孔加入100 μL稀釋好的DCFH-DA工作液，37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱孵育30 min。用無血清MEM培養(yǎng)基洗滌細胞3次，每孔加入100 μL MEM培養(yǎng)基。在酶標儀中使用激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm檢測熒光值。

使用SOD試劑盒考察空白組、模型組、給藥組、抑制劑組的HaCaT細胞SOD活性。ICI 182780組采用WST-8檢測法，ATRA組采用WST-1檢測法。按說明書操作計算。

3 結果

3.1 質粒載體轉化的驗證及質量的測定通過基因測序得2 098 bp，將該序列與已知質粒進行比對，同源性99%，其中測序序列結果中包含ARE序列，證明轉化成功。質粒濃度為158.00 mg·L-1，純度為1.97。

3.2 黃芩主要活性成分對293T細胞活力的影響如Fig 1所示，黃芩苷(1、10、100 μmol·L-1)組293T細胞活力與正常對照組相比差異無顯著性，漢黃芩素和黃芩素1 μmol·L-1組293T細胞活力與正常對照組相比差異無顯著性。1、10、100 μmol·L-1為黃芩苷對293T細胞的安全濃度，1 μmol·L-1為漢黃芩素和黃芩素的安全濃度。采用黃芩苷、漢黃芩素和黃芩素的安全濃度進行抗氧化活性的篩選。

3.3 黃芩抗氧化活性成分的篩選分別將黃芩苷(1、10、100 μmol·L-1)，漢黃芩素(0.2、0.5、1 μmol·L-1)和黃芩素(0.2、0.5、1 μmol·L-1)加入轉染了質粒DNA的293T細胞中，檢測報告基因的活性。Fig 2結果顯示，100 μmol·L-1黃芩苷可明顯激活293T細胞中的Nrf2-ARE通路，誘導表達倍數(shù)為空白組的(1.56±0.01)倍(P<0.01)；黃芩苷(1、10 μmol·L-1)誘導表達倍數(shù)與空白組比較差異均無顯著性。如Fig 3所示，漢黃芩素和黃芩素0.2、0.5、1 μmol·L-13個濃度的誘導表達倍數(shù)均小于1，無抗氧化活性。

Fig 1 Effect of scutellarin, baicalein, baicalin on cell viability of 293T n=6)

**P<0.01vscontrol

Fig 2 Effect of baicalin on luciferase induction

**P<0.01vscontrol

Fig 3 Effect of scutellarin, baicalein on luciferase induction in 293T

A:Control;B:tBHQ;C:0.2 μmol·L-1of scutellarin;D: 0.5 μmol·L-1of scutellarin;E: 1 μmol·L-1of scutellarin;F: 0.2 μmol·L-1of baicalein;G: 0.5 μmol·L-1of baicalein;H: 1 μmol·L-1of baicalein.**P<0.01vscontrol

3.4 黃芩主要活性成分通過雌激素受體影響Nrf2-ARE通路如Fig 4所示，預給予雌激素受體特異性抑制劑ICI 182780后，誘導表達倍數(shù)下降至(1.02±0.23)倍，抗氧化作用基本消失。

Fig 4 Effect of ICI 182780 on luciferase-upregulation

**P<0.01vscontrol

3.5 驗證黃芩主要活性成分通過雌激素受體影響Nrf2-ARE通路Tab 1結果顯示，與模型組比較，黃芩苷(100 μmol·L-1)對HaCaT細胞有明顯的抗氧化作用。預給予雌激素受體特異性抑制劑ICI 182780后，ROS值升高，SOD值下降，抗氧化作用消失。表明黃芩苷可能通過雌激素受體發(fā)揮抗氧化作用。

Tab 1 Regulation of baicalin on ROS and SOD levels in UVB-irradiated HaCaT cells after ICI 182780

**P<0.01vsmodel

3.6 驗證黃芩主要活性成分通過Nrf2-ARE通路發(fā)揮抗氧化作用Tab 2結果顯示，與模型組比較，黃芩苷(100 μmol·L-1)對HaCaT細胞有明顯的抗氧化作用。預給予Nrf2-ARE通路特異性抑制劑ATRA后，ROS值升高，SOD值下降，抗氧化作用消失。表明黃芩苷可能通過Nrf2-ARE通路發(fā)揮抗氧化作用。

4 討論

本研究采用基因載體pGL4.37-ARE與內對照報告基因載體pRL-TK共轉染293T細胞，建立雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)，檢測293T細胞中相關蛋白表達，并將其誘導表達倍數(shù)歸一化，以消除實驗中不同測試之間所固有的變化，從而篩選出可明顯激活293T細胞中的Nrf2-ARE通路的活性成分黃芩苷，并為后續(xù)單體抗氧化成分的開發(fā)提供實驗依據。

Tab 2 Regulation of baicalin on ROS and SOD levels in UVB-irradiated HaCaT cells after ATRA

*P<0.05,**P<0.01vsmodel

文獻報道，黃芩苷可以下調Keap1表達、上調Nrf2蛋白水平，過量的Nrf2由胞質向核內轉移，與ARE調控序列結合，啟動下游SOD等基因和蛋白表達，從而清除氧自由基[10]，實現(xiàn)抗氧化作用[6]。研究表明，黃芩苷(100 μmol·L-1)可緩解UVB照射所致HaCaT細胞內ROS的過量表達，提高SOD活性，從而達到對UVB照射導致的氧化應激的保護作用。預加入雌激素受體抑制劑和Nrf2-ARE通路抑制劑抗氧化作用消失，從而推斷黃芩苷可能是通過雌激素受體調節(jié)Nrf2-ARE通路發(fā)揮抗氧化作用。

黃芩素與黃芩苷化學結構相似，但在本研究構建的篩選模型中，在考察濃度范圍內黃芩素未表現(xiàn)出抗氧化作用。劉靖麗等[15]從密度泛函理論角度探討了黃芩素和黃芩苷抗氧化活性與結構關系，認為C6位的酚羥基是黃芩苷黃芩素的最大反應活性位點。在非極性溶劑中，抗氧化活性取決于脫氫能力，脫氫能力越強，抗氧化能力越強，黃芩苷的脫氫能力強于黃芩素，所以黃芩苷的抗氧化活性大于黃芩素；在極性溶劑中，抗氧化活性取決于電離勢，電離勢越低，抗氧化活性越強，黃芩苷的電離勢低于黃芩素，所以黃芩苷的抗氧化活性強于黃芩素。與本研究結果一致。

本研究成功建立了雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)，用于體外篩選具有抗氧化活性成分，并用UVB造模后的HaCaT細胞進行了驗證。結果發(fā)現(xiàn)，黃芩中主要活性成分黃芩苷通過雌激素受體影響Nrf2-ARE通路，發(fā)揮抗氧化作用。