李光偉，王 珺，肖 薇，金 莉，李 波，趙 宇，張寧寧，汪 娜

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]。鈣離子與鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在肺癌發(fā)生中起重要作用，但其具體機(jī)制尚未闡明。鈣敏感受體(calcium-sensing receptor，CaSR)是細(xì)胞膜上的一種G蛋白偶聯(lián)受體[2]，其在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮著重要作用，但CaSR在肺癌轉(zhuǎn)移中的作用鮮有報(bào)道。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，CaSR蛋白在人非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)增強(qiáng)，其表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤大小、腫瘤分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，提示在非小細(xì)胞肺癌中，CaSR的表達(dá)可能與腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。為探究CaSR在肺癌轉(zhuǎn)移中的具體機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)以A549及A549/DDP細(xì)胞為研究對(duì)象進(jìn)行研究，以期為肺癌的防治提供新的藥物作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞人肺腺癌細(xì)胞A549、耐順鉑人肺腺癌細(xì)胞A549/DDP，購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 試劑與儀器基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)ELISA試劑盒，購于美國R&D公司；Transwell小室，購于Corning公司；CaSR、MMP-2、Akt、p-Akt、GAPDH的一抗及二抗，均購于Santa Cruz公司；LY294002(PI3K/Akt通路抑制劑)、NPS2143(CaSR抑制劑)、GdCl3(CaSR激動(dòng)劑)，購于Sigma公司。缺氧培養(yǎng)箱及酶標(biāo)儀(Thermo)；倒置顯微鏡(Olympus)；DF-D型恒壓恒流電泳儀(北京六一廠)；高速離心機(jī)(美國Sigma公司)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及缺氧模型的復(fù)制A549及A549/DDP細(xì)胞在37 ℃、5% CO2條件下，含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，順鉑維持濃度為2 mg·L-1。將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞隨機(jī)進(jìn)行分組。對(duì)照組(control)：細(xì)胞無血清培養(yǎng)24 h后，正常培養(yǎng)箱無血清培養(yǎng)24 h；缺氧組(H)：細(xì)胞無血清培養(yǎng)24 h后，缺氧箱內(nèi)無血清培養(yǎng)24 h(93% N2、2% O2、5% CO2)；GdCl3干預(yù)組(H+Gd)：細(xì)胞無血清培養(yǎng)24 h，加入GdCl3(300 μmol·L-1)后，缺氧箱內(nèi)無血清培養(yǎng)24 h；NPS2143干預(yù)組(H+NPS)：細(xì)胞無血清培養(yǎng)24 h，加入NPS2143(10 μmol·L-1)后，缺氧箱內(nèi)無血清培養(yǎng)24 h；LY294002干預(yù)組(H+LY+Gd)：細(xì)胞無血清培養(yǎng)24 h，加入LY294002(10 μmol·L-1)孵育30 min后，加入GdCl3(300 μmol·L-1)，缺氧箱內(nèi)無血清培養(yǎng)24 h[4]。

1.4 Western blot檢測CaSR、MMP-2、Akt、p-Akt的蛋白水平各細(xì)胞組達(dá)到實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)后，細(xì)胞刮下后，加入蛋白裂解液及PMSF，冰上孵育40 min，4 ℃、12 000 r·min-1離心20 min，上清進(jìn)行蛋白定量。取20 μg蛋白樣品，10% SDS-PAGE電泳，300 mA轉(zhuǎn)移2 h至硝酸纖維素薄膜，封閉1 h；分別加入一抗MMP-2、Akt、p-Akt、GAPDH(1 ∶500)4 ℃過夜。洗膜，二抗(1 ∶1 000)孵育1 h，顯色發(fā)光，吸光度掃描，半定量分析顯影條帶[5-7]。

1.5 ELISA法檢測MMP-2含量收集各組細(xì)胞上清液，1 500 r·min-1離心10 min，取上清液1 mL待測。實(shí)驗(yàn)步驟按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。所有標(biāo)本均進(jìn)行3個(gè)復(fù)孔檢測，并為同批測定，均值為終質(zhì)量濃度。分別以標(biāo)準(zhǔn)物的質(zhì)量濃度及450 nm波長的吸光度(A)值為橫縱坐標(biāo)，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。在坐標(biāo)曲線上通過樣品A值，查出相應(yīng)的樣品質(zhì)量濃度(μg·L-1)[8]。

1.6 Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲情況按照基質(zhì)膠 ∶DMEM=1 ∶29比例稀釋后，向上室鋪基質(zhì)膠。細(xì)胞分組同“1.3”，各組細(xì)胞分別離心后用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度1.0×109·L-1種于上室，下室加入含有10% FBS的完全培養(yǎng)基600 μL，按照分組情況，分別于上室內(nèi)加藥后置于常氧及缺氧箱內(nèi)培養(yǎng)24 h；將上室取出，用棉簽擦去上室內(nèi)未遷移的細(xì)胞，PBS沖洗2次；甲醇固定上室細(xì)胞20 min；PBS沖洗2次，適當(dāng)風(fēng)干后，0.5%結(jié)晶紫染色20 min，PBS沖洗2次，風(fēng)干。倒置顯微鏡高倍鏡下任意選取5個(gè)不相同的視野，拍照并計(jì)數(shù)細(xì)胞[9]。

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移情況細(xì)胞分組同“1.3”。取2塊6孔板，用marker筆分別在每塊板背面劃橫線，每隔0.5～1 cm劃一道，橫穿過孔，每孔至少穿過5條線。每孔加入約5×105個(gè)細(xì)胞，以過夜能鋪滿為標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)胞貼壁后去血清24 h。次日用200 μL的槍頭比著直尺，垂至于背后的橫線劃痕。PBS沖洗3次，去除劃下的細(xì)胞，按分組情況分別處理及加藥，其中一塊板置于正常培養(yǎng)箱內(nèi)，另一塊板置于缺氧箱內(nèi)，分別培養(yǎng)24 h。取樣，拍照[10]。分別測量0 h和24 h的劃痕寬度，遷移距離=0 h的劃痕寬度-24 h的劃痕寬度。

2 結(jié)果

2.1 不同處理因素對(duì)CaSR表達(dá)的影響如Fig 1所示，與對(duì)照組比較，H組CaSR表達(dá)增加(P<0.05)；與H組比較，GdCl3能增加CaSR表達(dá)(P<0.05)，CaSR抑制劑NPS2143的作用相反，A549/DDP細(xì)胞CaSR蛋白表達(dá)結(jié)果與A549細(xì)胞一致。

Fig 1 The protein expression of CaSR determined by Western blot in different groups of A549 and A549/DDP

H: hypoxia, NPS: NPS2143.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH group.

2.2 不同處理因素對(duì)細(xì)胞MMP-2蛋白表達(dá)的影響如Fig 2所示，與對(duì)照組比較，H組MMP-2蛋白表達(dá)增加(P<0.05)；與H組比較，缺氧基礎(chǔ)上GdCl3和NPS2143分別能上調(diào)和下調(diào)這種作用(P<0.05)；與H+GdCl3組比較，LY294002能夠抑制MMP-2蛋白的表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，A549/DDP細(xì)胞MMP-2的變化趨勢與A549細(xì)胞一致。

2.3 不同處理因素對(duì)p-Akt蛋白水平的影響2種細(xì)胞Western blot檢測結(jié)果顯示(Fig 3)，與對(duì)照組比較，缺氧能夠上調(diào)Akt蛋白磷酸化水平(P<0.05)；與H組比較，缺氧基礎(chǔ)上GdCl3能夠進(jìn)一步增加其磷酸化的水平(P<0.05)；與H+GdCl3比較，這種促進(jìn)效應(yīng)可以被PI3K通路阻斷劑LY294002抑制(P<0.05)；NPS2143則與GdCl3作用相反。

Fig 2 The protein levels of MMP-2 in A549 and A549/DDP cells determined by Western

H: hypoxia; NPS:NPS2143; LY: LY294002.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH group;△P<0.05vsH+GdCl3group.

Fig 3 The protein levels of p-Akt in A549 and A549/DDP cells

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH group;△P<0.05vsH+GdCl3group

2.4 不同處理因素對(duì)細(xì)胞分泌MMP-2的影響如Fig 4所示，H組A549及A549/DDP細(xì)胞上清液中的MMP-2蛋白濃度高于對(duì)照組(P<0.05)，但卻明顯低于H+GdCl3組(P<0.05)，而缺氧和GdCl3的作用可被PI3K抑制劑LY294002所抑制(P<0.05)，NPS2143則與GdCl3作用相反。

Fig 4 Level of MMP-2 in A549 and A549/DDP cell cultured

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH group;△P<0.05vsH+GdCl3group

2.5 不同處理因素對(duì)細(xì)胞侵襲的影響Transwell結(jié)果顯示(Fig 5)，在A549及A549/DDP細(xì)胞，與對(duì)照組比較，H組平均每個(gè)高倍(400倍)視野穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)明顯增加(P<0.05)，提示缺氧可明顯增加A549細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)侵襲能力。缺氧基礎(chǔ)上NPS2143能抑制A549細(xì)胞侵襲，GdCl3能促進(jìn)其侵襲(P<0.05)，但這種促進(jìn)作用可被LY294002阻斷(P<0.05)。

2.6 不同處理因素對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響如Fig 6所示，在A549細(xì)胞H組較對(duì)照組遷移距離增加(P<0.05)；與H組比較，NPS2143抑制細(xì)胞遷移(P<0.05)，GdCl3能促進(jìn)A549細(xì)胞的遷移(P<0.05)，而PI3K抑制劑LY294002則可抑制GdCl3的作用(P<0.05)，A549/DDP細(xì)胞遷移的變化趨勢與A549細(xì)胞一致。

3 討論

侵襲和轉(zhuǎn)移是臨床上惡性腫瘤患者治療失敗和死亡的主要原因，因此，揭示惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制，將有助于判斷患者預(yù)后和選擇合理、有效的治療方案, 延長患者的生存期限及提高生活質(zhì)量。目前，我國已為世界第一肺癌大國，因此肺癌的診療已成為我國臨床工作者面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。鈣離子作為細(xì)胞內(nèi)重要的信息分子，可以激活不同的信號(hào)通路，參

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH group;△P<0.05vsH+GdCl3group

與許多重要生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)。惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程常伴隨鈣離子信號(hào)的異常，但其發(fā)生機(jī)制不甚清楚。因此，認(rèn)識(shí)鈣信號(hào)在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，對(duì)于進(jìn)一步揭示肺癌發(fā)生的分子機(jī)制，改善患者預(yù)后，提高其生存質(zhì)量有重要意義。

CaSR是G蛋白偶聯(lián)受體C家族成員之一。Brown等[2]于1993年首先從牛的甲狀旁腺中克隆出CaSR。CaSR在維持全身鈣的平衡系統(tǒng)中具有重要作用，此外，還可參與細(xì)胞增殖、分化、分泌、趨化、凋亡、基因表達(dá)、離子通道開關(guān)、維持膜電位、衰老等過程。大量研究表明，CaSR在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。CaSR是影響乳腺癌預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子[11-12]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CaSR蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)增強(qiáng)，其表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤大小、腫瘤分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)，提示在非小細(xì)胞肺癌中CaSR的表達(dá)或活化可能與腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)[3]。但其具體發(fā)生機(jī)制如何，目前尚無相關(guān)報(bào)道。

眾所周知，實(shí)質(zhì)性腫瘤細(xì)胞物理微環(huán)境的基本特征之一是缺氧，缺氧可活化多種細(xì)胞膜上的CaSR[13]。研究中，我們觀察到缺氧能夠上調(diào)A549及A549/DDP細(xì)胞CaSR蛋白的表達(dá)，在此基礎(chǔ)上，GdCl3能夠進(jìn)一步加強(qiáng)CaSR的表達(dá)，而CaSR抑制劑NPS2143能減弱CaSR的表達(dá)，說明缺氧能夠活化A549及A549/DDP細(xì)胞的CaSR。

Brennan等[14]研究表明，激活的CaSR能夠促進(jìn)乳腺癌及前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生。新近研究揭示，CaSR在體內(nèi)和體外促進(jìn)腎細(xì)胞癌的骨轉(zhuǎn)移進(jìn)程[15]。本研究結(jié)果顯示，缺氧促進(jìn)A549及A549/DDP細(xì)胞遷移距離，增加穿過濾膜細(xì)胞數(shù)量和侵襲能力。上述這些作用能夠被CaSR激動(dòng)劑GdCl3所增強(qiáng)，被CaSR激動(dòng)劑NPS2143所抑制，提示缺氧活化的CaSR可能參與了A549及A549/DDP細(xì)胞的遷移和侵襲過程。

基底膜或細(xì)胞外基質(zhì)的降解是腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)，MMP-2和MMP-9能有效降解基底膜或細(xì)胞外基質(zhì)，在腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移灶的形成過程中起重要作用。本研究顯示，缺氧組A549及A549/DDP細(xì)胞MMP-2蛋白表達(dá)增多，同時(shí)分泌到培養(yǎng)液中的MMP-2蛋白濃度增加，GdCl3能上調(diào)缺氧的這種效應(yīng)，NPS2143作用相反。說明缺氧活化的CaSR可能通過促進(jìn)A549及A549/DDP細(xì)胞MMP-2蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)A549及A549/DDP細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移的進(jìn)程。

PI3K/Akt通路是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的經(jīng)典信號(hào)途徑之一，為進(jìn)一步探索PI3K/Akt通路在缺氧活化CaSR促進(jìn)A549細(xì)胞侵襲的作用，我們選用了PI3K信號(hào)通路的抑制劑LY294002進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，LY294002能夠減弱GdCl3所引起的細(xì)胞侵襲效應(yīng)，表現(xiàn)為細(xì)胞遷移距離減少，穿過濾膜細(xì)胞的數(shù)量減少；蛋白檢測結(jié)果顯示，缺氧能夠增加Akt蛋白磷酸化水平，GdCl3能增強(qiáng)缺氧的作用，但該作用被LY294002所減弱。這些結(jié)果均提示，PI3K/Akt信號(hào)通路在缺氧活化CaSR促進(jìn)A549及A549/DDP細(xì)胞侵襲中起重要作用。

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH group;△P<0.05vsH+GdCl3group

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝課題組成員的支持和協(xié)助。)