蔡煒龍 余勝 汪偉民 許洪寶 樓能

膽囊癌是膽道系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其惡性程度高，5年生存率低于5%[1]。由于膽囊癌早期癥狀并不顯著，易被忽略，且膽囊癌的進(jìn)展較快，易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，發(fā)現(xiàn)時(shí)多處于晚期，失去治療的機(jī)會(huì)[2-3]。CD44是一種透明質(zhì)酸受體，參與細(xì)胞黏附、淋巴細(xì)胞遷移、歸巢等過程[4]。近年來越來越多的研究開始關(guān)注CD44的功能，研究發(fā)現(xiàn)CD44在前列腺癌、三陰性乳腺癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤中異常高表達(dá)，并且CD44的異常表達(dá)與惡性腫瘤的預(yù)后相關(guān)[5-8]。而CD44在膽囊癌中的表達(dá)及其作用研究報(bào)道較少。本研究擬通過觀察CD44對(duì)人膽囊癌細(xì)胞株EH-GB1和GBC-SD增殖、侵襲和遷移的影響，探討CD44對(duì)膽囊癌細(xì)胞的作用，為防治膽囊癌尋找可能有效的治療靶標(biāo)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人膽囊癌細(xì)胞株EH-GB1和GBC-SD由中國(guó)科學(xué)院上海生命研究院細(xì)胞資源中心提供。用10%DMEM培養(yǎng)基并加入1%的鏈霉素和青霉素，置于5%CO2培養(yǎng)箱、37°C 培養(yǎng)。

1.2 試劑與耗材 CD44抗體、兔二抗購(gòu)自美國(guó)CST公司，培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibico公司，CCK8試劑盒、結(jié)晶紫、BCA試劑盒等購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司,siCD44購(gòu)自上海拓然生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分組和轉(zhuǎn)染siRNA 分別將EH-GB1和GBCSD細(xì)胞分為陰性對(duì)照組（si-NC組）和siRNA干擾技術(shù)沉默CD44實(shí)驗(yàn)組（si-CD44組），si-NC組轉(zhuǎn)染si-NC，si-CD44組轉(zhuǎn)染si-CD44。分別將GBC-SD和EH-GB1鋪于6孔板內(nèi)，24h后，根據(jù)說明書，用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染膽囊癌細(xì)胞，每6孔板內(nèi)轉(zhuǎn)染50nmol siRNA，轉(zhuǎn)染6h后，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。待48h后收集膽囊癌細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 CCK8細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞常規(guī)消化、離心、重懸后計(jì)數(shù)，將細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，每孔細(xì)胞數(shù)1 000個(gè)，每組處理細(xì)胞設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，放于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。分別于6h、第1、2、3、4、5天加入10%CCK8，37°C避光孵育2h后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm時(shí)的吸光度（OD）值。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 Transwell侵襲、遷移實(shí)驗(yàn) Transwell小室實(shí)驗(yàn)分為遷移小室實(shí)驗(yàn)和侵襲小室實(shí)驗(yàn)，前者無(wú)基質(zhì)膠而后者有基質(zhì)膠。實(shí)驗(yàn)前將Transwell侵襲小室置于24孔培養(yǎng)基內(nèi)水化。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞常規(guī)消化、離心，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基重懸后計(jì)數(shù)。在Transwell小室上室內(nèi)加入 200μl（2萬(wàn)個(gè)細(xì)胞）培養(yǎng)基，下室加入 500μl 10%DMEM，孵育24h。取出Transwell小室，吸走小室內(nèi)培養(yǎng)基，向下室加入多聚甲醛，室溫固定20min，然后加入0.1%結(jié)晶紫染色，室溫染色20min，擦掉未遷移的細(xì)胞后晾干，顯微鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)不同視野的細(xì)胞數(shù)。

1.3.4 Western blot實(shí)驗(yàn) 膽囊癌細(xì)胞經(jīng)過轉(zhuǎn)染si-CD44 48h后，棄上清液，用PBS清洗2次，加入RIPA細(xì)胞裂解液裂解20min，進(jìn)行離心。利用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。樣品加入6×蛋白上樣緩沖液煮沸變性。聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行電泳，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用5%脫脂奶費(fèi)常溫封閉1h，隨后在一抗4℃孵育過夜，第2天用TBST進(jìn)行洗膜，孵育二抗1h。結(jié)束后，用電化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行顯影、曝光。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值，計(jì)量資料以表示，兩組比較用采用Student’t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染si-CD44后兩組細(xì)胞內(nèi)CD44的表達(dá)情況見圖1。

圖1 轉(zhuǎn)染si-CD44后兩組細(xì)胞CD44表達(dá)情況比較（a：蛋白表達(dá)電泳圖；b：RT-PCR結(jié)果比較，與si-NC組比較，**P＜0.01）

由圖1可見，與si-NC組相比，si-CD44組的條帶明顯變細(xì)，表明其CD44蛋白表達(dá)量明顯降低，siRNA基因沉默效果好（圖1a）；通過RT-PCR再次驗(yàn)證，si-CD44組中CD44表達(dá)量明顯低于si-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），進(jìn)一步表明si-CD44組基因沉默效果好（圖1b）。

2.2 轉(zhuǎn)染si-CD44后兩組細(xì)胞增殖情況 見表1、2及圖2。

由表1、2及圖2可見，EH-GB1和GBC-SD細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-CD44后，CCK8增殖實(shí)驗(yàn)表明，與si-NC組相比，si-CD44組的增殖無(wú)明顯變化，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.3 轉(zhuǎn)染si-CD44后兩組細(xì)胞遷移情況 見圖3。

由圖3可見，Transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)顯示，在人膽囊癌細(xì)胞系EH-GB1中，si-NC組的穿膜細(xì)胞數(shù)為（193.7±3.9）個(gè)，明顯大于 si-CD44 組的（88.7±5.8）個(gè)（t=15.12，P＜0.05）；在人膽囊癌細(xì)胞系 GBC-SD 中，si-NC組的穿膜細(xì)胞數(shù)為（193.7±7.8）個(gè)，明顯大于si-CD44組的（110.3±5.5）個(gè)（t=10.42，P＜0.05）；si-CD44 組與si-NC組相比，遷移細(xì)胞數(shù)目明顯減少。

2.4 轉(zhuǎn)染si-CD44后兩組細(xì)胞侵襲情況 見圖4。

由圖4可見，Transwell小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，在人膽囊癌細(xì)胞系EH-GB1中，si-NC組的穿膜細(xì)胞數(shù)為（175.3±7.5）個(gè)，明顯大于 si-CD44組的（85.3±3.7）個(gè)（t=10.74，P＜0.05）；在人膽囊癌細(xì)胞系 GBC-SD 中，si-NC組的穿膜細(xì)胞數(shù)為（188.0±9.0）個(gè)，明顯大于si-CD44 組的（73.0±3.6）個(gè)（t=11.84，P＜0.05）；si-CD44 組與si-NC組相比，侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯減少。

表1 EH-GB1轉(zhuǎn)染si-CD44后兩組細(xì)胞OD值比較

表2 GBC-SD轉(zhuǎn)染si-CD44后兩組細(xì)胞OD值比較

圖2 CCK8增殖實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

圖3 轉(zhuǎn)染si-CD44后EH-GB1和GBC-SD細(xì)胞遷移情況（a:兩組細(xì)胞結(jié)晶紫染色示意圖，×200；b：兩組穿膜細(xì)胞數(shù)比較，與si-NC組比較，*P＜0.05）

3 討論

膽囊癌作為膽道系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，惡性程度較高，易侵犯周圍臟器及向淋巴結(jié)等器官轉(zhuǎn)移,尋找有效的標(biāo)志物在膽囊癌疾病診斷和治療中具有重要意義。CD44是一種膜整合蛋白，是跨膜透明質(zhì)酸的主要受體，是一種多功能的蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與基質(zhì)間的接觸和結(jié)合，參與了很多重要的生物學(xué)過程[7]，其陽(yáng)性表達(dá)對(duì)多種惡性腫瘤的不良結(jié)局起重要作用。Hsu等[8]發(fā)現(xiàn)CD44在胰腺癌組織中高表達(dá)，并與胰腺癌的不良預(yù)后相關(guān)，Wood等[9]報(bào)道CD44與胰腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。Gao等[10]利用慢病毒介導(dǎo)的siRNA敲低肝細(xì)胞系中CD44表達(dá)后發(fā)現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化表型被逆轉(zhuǎn)，從而使癌細(xì)胞在體外遷移及侵襲能力減弱，Yang等[11]發(fā)現(xiàn)伴CD44高表達(dá)的肝細(xì)胞肝癌中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）也同時(shí)升高，并且組織中微血管密度（MVD）明顯上升，與腫瘤血管生成、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移有關(guān)。此外，CD44能夠促進(jìn)結(jié)腸癌和乳腺癌的侵襲、遷移，可能是腫瘤細(xì)胞內(nèi)CD44的異常高表達(dá)通過增加其與細(xì)胞外基質(zhì)配體透明質(zhì)酸的親和力，增強(qiáng)了腫瘤的侵襲性[12-13]。還有研究表明，siRNA介導(dǎo)的CD44下調(diào)可顯著減弱骨肉瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和生存能力,這可能是通過CD44與透明質(zhì)酸的相互作用增加嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（SCID）小鼠骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的形成[14]。另有研究認(rèn)為，CD44可以作為臨床早期診斷結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的生物學(xué)指標(biāo)[15]。CD44通過與透明質(zhì)酸結(jié)合，對(duì)細(xì)胞存活、抗凋亡蛋白的活化有一定的影響，從而導(dǎo)致肝癌和肺癌的腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生[16-17]。此外，CD44的表達(dá)也被認(rèn)為是預(yù)測(cè)骨肉瘤、卵巢癌和胃癌化療敏感性的重要生物標(biāo)志物[14，18-19]。這些結(jié)果均表明CD44作為惡性腫瘤生物靶標(biāo)的可能性。

圖4 轉(zhuǎn)染si-CD44后EH-GB1和GBC-SD細(xì)胞侵襲情況（a:兩組細(xì)胞結(jié)晶紫染色示意圖，×200；b：兩組穿膜細(xì)胞數(shù)比較，與si-NC組比較，*P＜0.05）

人膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD來源于低分化膽囊癌患者原位瘤組織，能反映原腫瘤細(xì)胞特性，而EH-GB1取材于膽囊癌患者的腹壁轉(zhuǎn)移灶，能反映出膽囊癌的高轉(zhuǎn)移活性，因此，同時(shí)以它們作為載體，可以較準(zhǔn)確的反映膽囊癌的生物學(xué)特性。本研究中筆者運(yùn)用RNA干擾技術(shù)在膽囊癌細(xì)胞中敲低CD44的表達(dá)，Western blot及RT-PCR均顯示，EH-GB1和GBC-SD細(xì)胞中CD44蛋白表達(dá)量均明顯降低。通過CCK8增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲低CD44后對(duì)體外膽囊癌細(xì)胞EH-GB1和GBC-SD的增殖能力均無(wú)明顯影響；而遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，si-NC組24h的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于si-CD44組，提示沉默CD44基因后，人膽囊癌細(xì)胞株EH-GB1和GBC-SD遷移和侵襲能力均明顯受到抑制，表明CD44可能通過影響膽囊癌細(xì)胞的侵襲遷移能力從而促進(jìn)膽囊癌的發(fā)生、發(fā)展，這可能由于CD44作為多功能細(xì)胞表面黏附分子，通過對(duì)膽囊癌細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)合產(chǎn)生影響，而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，但其具體機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以往研究結(jié)果一致[20]。這些結(jié)果表明CD44可能作為膽囊癌治療的新靶點(diǎn)，通過抑制CD44的表達(dá)，可能有效防止膽囊癌的侵襲及轉(zhuǎn)移，為膽囊癌的治療提供了新的思路。

綜上所述，CD44在膽囊癌中表達(dá)與人膽囊癌細(xì)胞EH-GB1和GBC-SD的侵襲及遷移密切相關(guān)，沉默EH-GB1和GBC-SD中CD44的表達(dá)，可顯著抑制其侵襲、轉(zhuǎn)移活性，這可能會(huì)為膽囊癌的治療提供新的分子靶點(diǎn)，但是CD44調(diào)控膽囊癌的侵襲遷移能力的具體機(jī)制仍待進(jìn)一步探索。