姚濤 王翠芳 張琦 徐露 崔琴 彭勃 高巖 李剛

動(dòng)脈硬化程度是腦卒中、急性心肌梗死、心力衰竭等心血管事件的危險(xiǎn)因素[1-2]，能夠預(yù)測(cè)正常人群和慢性腎病患者心血管病死亡率及全因死亡率[3-4]。臨床用于評(píng)估動(dòng)脈硬化的方法有多種，頸-股動(dòng)脈脈搏波傳導(dǎo)速度（carotid-femoral pulse wave velocity,cfPWV）是用作衡量動(dòng)脈硬化水平的重要指標(biāo)[5-8]。除高血壓、吸煙、高脂血癥、糖尿病等常見心腦血管疾病危險(xiǎn)因素能導(dǎo)致動(dòng)脈硬化外，研究發(fā)現(xiàn)炎癥及免疫機(jī)制在動(dòng)脈硬化的進(jìn)展中也具有重要的作用[9-11]。血管緊張素Ⅱ1型受體自體抗體（autoantibodies againstangiotensinⅡ type 1 receptor,AT1-AAs）和α1-腎上腺素受體自體抗體（au－toantibodies against alpha1-adrenergic receptor，α1-AAs）作為自身免疫反應(yīng)的產(chǎn)物，能夠?qū)е卵軗p傷和心室重構(gòu)[12-13]，與高血壓病發(fā)病密切相關(guān)[14]。在血壓正常者中，AT1-AAs和α1-AAs能否通過(guò)相關(guān)機(jī)制致使血管重構(gòu)、動(dòng)脈硬化，從而導(dǎo)致發(fā)生高血壓，目前還沒有較多研究。因此，本研究對(duì)血壓正常人群進(jìn)行AT1-AAs和α1-AAs水平檢測(cè)并進(jìn)行5年時(shí)間的隨訪，探討AT1-AAs和α1-AAs這兩種自體抗體與動(dòng)脈硬化進(jìn)展的關(guān)系。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 根據(jù)世界衛(wèi)生組織的指南，選擇2010年9月至2011年3月于湖北省中醫(yī)院進(jìn)行健康體檢者1 148例，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）正常血壓（收縮壓＜140mmHg和舒張壓＜90mmHg）；（2）18 周歲以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患有心力衰竭、心肌病、冠心病以及其他器質(zhì)性心臟病者；（2）患腦血管病、外周動(dòng)脈疾病、糖尿病者。在2010年12月至2016年4月期間，電話隨訪每3個(gè)月1次，門診隨訪每年1次，失訪332例，完成5年隨訪816例（71.1%），男476例，女340例，年齡（39.1±7.8）歲。

1.2 研究方法

1.2.1 一般指標(biāo)收集 記錄研究對(duì)象的年齡、性別、既往史、吸煙、收縮壓、舒張壓、身高、體重等臨床資料，并計(jì)算 BMI；記錄研究對(duì)象空腹 TG、TC、LDL-C、HDL-C、空腹血糖、血肌酐（Cr）等生化指標(biāo)。記錄隨訪過(guò)程中確診高血壓者高血壓的發(fā)病時(shí)間（入組時(shí)至隨訪中確診高血壓的時(shí)間）。

1.2.2 cfPWV檢測(cè) 采用澳大利亞AtCor Medical的SphygmoCor儀于上午 8：00～10：00，室溫控制在 22～25℃時(shí)測(cè)量研究對(duì)象的cfPWV。受試者在檢測(cè)室內(nèi)安靜休息 5min后取仰臥位連接心電圖，將壓力記錄探頭放置于其右頸動(dòng)脈及股動(dòng)脈體表采樣點(diǎn)。使用皮尺測(cè)量頸動(dòng)脈至股動(dòng)脈體表采樣點(diǎn)之間的距離，記錄心電圖波形校正的頸動(dòng)脈及股動(dòng)脈波形并計(jì)算兩者之間的時(shí)間差，連續(xù)記錄10次兩種波形時(shí)間差并計(jì)算平均值。cfPWV（m/s）=兩個(gè)采樣點(diǎn)之間的距離間的距離（m）/兩個(gè)波形時(shí)間差平均值（s）。對(duì)每位受試者重復(fù)測(cè)量3次，每次間隔5 min，取 3次的平均值為最后結(jié)果。入組時(shí)和5年后隨訪時(shí)各檢測(cè)1次，兩次cfPWV結(jié)果分別記錄為基線cfPWV和隨訪cfPWV。定義 ΔcfPWV（m/s）=隨訪 cfPWV-基線 cfPWV（m/s），年平均 ΔcfPWV=ΔcfPWV/5（m/s）；將研究對(duì)象基線 cfPWV≤10m/s且隨訪時(shí)cfPWV＞12m/s定義為動(dòng)脈硬化進(jìn)展。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，多組間比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。變量之間的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)，將性別及單因素分析P＜0.1的變量納入多因素線性回歸分析；采用Cox回歸模型分析AT1-AAs和α1-AAs不同表達(dá)類型者動(dòng)脈硬化進(jìn)展及高血壓患病風(fēng)險(xiǎn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AT1-AAs和α1-AAs水平檢測(cè) 結(jié)果與分組根據(jù)研究對(duì)象的兩種抗體水平將其分為 4 組：AT1（-）、α1（-）為 A 組；AT1（+）、α1（-）為 B 組；AT1（-）、α1（+）為 C組；AT1（+）、α1（+）為 D 組，分別為 521、132、97、66 例。

2.2 研究對(duì)象一般資料 入組的816例研究對(duì)象基線收縮壓為（125.9±9.4）mmHg，舒張壓（75.2±7.1）mmHg,脈壓差（50.7±9.5）mmHg，平均動(dòng)脈壓（92.1±6.5）mmHg；基線cfPWV為（9.90±0.84）m/s，5年后隨訪時(shí) cfPWV 為（10.51±1.12）m/s。年平均 cfPWV 變化值（ΔcfPWV）為（0.12±0.08）m·s-1·y-1。隨訪結(jié)束時(shí)，研究對(duì)象確診高血壓129例，出現(xiàn)動(dòng)脈硬化進(jìn)展144例。不同自體抗體表達(dá)類型4組基線資料比較見表1。

由表1可見，A組的年齡、BMI、心率低于其它3

1.2.3 檢測(cè)AT1-AAs和α1-AAs表達(dá) 采用Zhao等[15]在研究中的使用的方法合成多肽以及檢測(cè)血清AT1-AAs和α1-AAs表達(dá)。首先，使用日本島津公司的PSSM-8型多肽自動(dòng)合成儀合成具有抗原決定簇的AT1-受體和α1-受體細(xì)胞外第二環(huán)多肽片段；再將AT1-受體和α1-受體多肽片段溶解于0.1mmol/L的碳酸緩沖液中（pH=9.6），配成 100μg/ml和 50μg/ml的抗原包被液，以每100μl的量包被反應(yīng)孔，4℃冰箱過(guò)夜。加1%FBS白蛋白并PBS封閉，37℃溫浴2h，用PBS緩沖液洗滌3次，加入稀釋血清，37℃溫浴2h，PBS洗滌 3次，加入 1∶2 000辣根過(guò)氧化物酶酶標(biāo)抗體（珠海海泰公司），37℃溫浴 1h，再加入雙氧水和 TMB溫浴放置，充分顯色后加入2mol/L硫酸終止反應(yīng),在酶標(biāo)儀上以450nm波長(zhǎng)測(cè)定光密度（A值）。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置空白對(duì)照和陽(yáng)性、陰性對(duì)照，測(cè) A值時(shí)以空白對(duì)照凋零，以保證檢測(cè)結(jié)果可靠性。以健康人群為參考血清，取A值超出對(duì)照健康人群2倍標(biāo)準(zhǔn)差的患者血清標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照血清。研究血清與陰性血清的吸光度之比[（標(biāo)本A值-空白對(duì)照A值）/（陰性對(duì)照A值-空白對(duì)照A值）] ＞2.1倍者判為抗體檢測(cè)陽(yáng)性。個(gè)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；而4組間性別、吸煙、空腹血糖、收縮壓、舒張壓、脈壓差、平均動(dòng)脈壓、TC、TG、LDL-C、HDL-C 及 Cr比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.3 不同自體抗體表達(dá)類型4組動(dòng)脈硬化進(jìn)展及高血壓患病情況的比較 見表2。

表1 不同自體抗體表達(dá)類型4組基線資料比較

表2 不同自體抗體表達(dá)類型4組動(dòng)脈硬化進(jìn)展及高血壓患病情況的比較

由表 2可見，B、C、D 組 ΔcfPWV、年平均 ΔcfPWV均短于A組，而高血壓的發(fā)病時(shí)間小于A組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。D組的動(dòng)脈硬化進(jìn)展以及高血壓患病比率顯著高于其它3組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.4 基線指標(biāo)與動(dòng)脈硬化進(jìn)展的關(guān)系 分析144例出現(xiàn)動(dòng)脈硬化進(jìn)展者的基線指標(biāo)，它們與動(dòng)脈硬化進(jìn)展的關(guān)系見表3。

表3 基線指標(biāo)與動(dòng)脈硬化進(jìn)展的關(guān)系

由表3可見，單因素相關(guān)分析結(jié)果顯示，年齡、BMI、收縮壓、心率、基線自體抗體類型以及基線cfPWV與動(dòng)脈硬化進(jìn)展相關(guān)（均P＜0.05）。

2.5 基線自體抗體與ΔcfPWV、年平均ΔcfPWV的關(guān)系 在調(diào)整年齡、性別、BMI、收縮壓、平均動(dòng)脈壓、心率、基線cfPWV、TC、吸煙因素后，多因素線性回歸分析結(jié)果顯示，基線自體抗體是影響ΔcfPWV和年平均ΔcfPWV的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見表4。

表4 基線自體抗體與ΔcfPWV、年平均ΔcfPWV的關(guān)系

2.6 不同自體抗體表達(dá)類型與動(dòng)脈硬化進(jìn)展和高血壓患病的關(guān)系 見表5。

表5 不同自體抗體表達(dá)類型與動(dòng)脈硬化進(jìn)展和高血壓患病的關(guān)系

由表5可見，在調(diào)整年齡、性別、BMI、收縮壓、平均動(dòng)脈壓、心率和基線cfPWV因素后，Cox回歸模型分析結(jié)果顯示，D組動(dòng)脈硬化進(jìn)展和高血壓患病風(fēng)險(xiǎn)明顯高于A組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

3 討論

本研究對(duì)816例血壓正常研究對(duì)象進(jìn)行平均5年的隨訪，研究發(fā)現(xiàn)AT1-AAs和α1-AAs是動(dòng)脈硬化進(jìn)展獨(dú)立的危險(xiǎn)因素。不同類型的抗體陽(yáng)性其動(dòng)脈硬化進(jìn)展的程度也不相同，在調(diào)整自變量影響后，AT1-AAs和α1-AAs均為陽(yáng)性者其動(dòng)脈硬化的進(jìn)展程度要顯著的高于單一抗體陽(yáng)性或兩個(gè)抗體均為陽(yáng)性者。AT1-AAs和α1-AAs陽(yáng)性者原發(fā)性高血壓的患病風(fēng)險(xiǎn)要顯著的高于抗體陰性者。

國(guó)內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn)，免疫及炎癥在心血管疾病發(fā)病機(jī)制中具有重要的作用。

Schiffrind 等[16]、Caillon 等[17]研究表明，免疫炎癥機(jī)制參與了動(dòng)脈硬化及高血壓的病理進(jìn)程。自1999年Wallukat等[18]首次在先兆子癇患者的血清中發(fā)現(xiàn)了AT1-AAs以來(lái)，該自體抗體被證實(shí)存在于高血壓、動(dòng)脈硬化、心力衰竭等多種心血管疾病患者的血清中，隨后對(duì)AT1-AAs的心血管效應(yīng)、作用機(jī)制和臨床意義的研究已引起了廣泛關(guān)注。2004年Wallukat等[18]研究發(fā)現(xiàn)該自體抗體能增加乳鼠心肌細(xì)胞的收縮能力和頻率，發(fā)揮著與AngⅡ類似的激動(dòng)劑效應(yīng)。在我們的研究人群中，AT1-AAs陽(yáng)性患者的心率較陰性患者顯著增加。此外，AngⅡ可作用于血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）的 AT1R，促進(jìn)內(nèi)層平滑肌細(xì)胞增殖，并遷移至血管內(nèi)膜，導(dǎo)致血管壁增厚，管腔狹窄，從而引起血管重塑[19]。AT1-AAs在各級(jí)血管中也具有激動(dòng)劑樣效應(yīng)。Jin等[20]采用主動(dòng)免疫法建立AT1R-AA陽(yáng)性大鼠模型，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組大鼠的主動(dòng)脈內(nèi)膜出現(xiàn)不同程度的增厚，內(nèi)膜VSMC排列失序，VSMC的增殖使得外周血管發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能重塑，進(jìn)而導(dǎo)致動(dòng)脈硬化的發(fā)生。Li等[21]也發(fā)現(xiàn)AT1-AAs通過(guò)作用于內(nèi)皮細(xì)胞的AT1受體，通過(guò)炎癥及免疫調(diào)節(jié)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、單核細(xì)胞集聚以及炎癥增生，從而參與動(dòng)脈硬化的發(fā)生、發(fā)展。大量研究的結(jié)果顯示，AT1-AAs與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能障礙密切相關(guān)，我們推測(cè)這可能是AT1-AAs參與動(dòng)脈硬化以及心血管疾病的機(jī)制之一。α1-AAs為IgM或IgG型免疫球蛋白，具有去甲腎上腺素樣作用。Zhou等[22]研究發(fā)現(xiàn)α1-AAs可通過(guò)上調(diào)c-jun的表達(dá)，刺激VSMC的增殖、心肌細(xì)胞的搏動(dòng)頻率，導(dǎo)致心臟和血管重塑。Yan等[23]通過(guò)對(duì)大鼠模型8個(gè)月的觀察研究，發(fā)現(xiàn)大鼠血管內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間存在α1-AAs的可以導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能減退，通過(guò)巨噬細(xì)胞增生后逐步引起血管損傷及內(nèi)皮增生。我們推測(cè)α1-AAs引起VSMC的增殖和血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷增生，是導(dǎo)致動(dòng)脈硬化的病理基礎(chǔ)。本研究中，α1-AAs陽(yáng)性者的心率較抗體陰性者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但動(dòng)脈硬化進(jìn)展和高血壓的發(fā)病率則顯著的增加。免疫和炎癥機(jī)制也參與了高血壓的發(fā)病過(guò)程[16，23]，其中AT1-AAs和α1-AAs通過(guò)刺激血管收縮、調(diào)節(jié)鈣離子通道以及血管炎癥反應(yīng)從而影響正常血壓[24-25]。Lei等[26]最新的一項(xiàng)薈萃分析結(jié)果顯示，AT1-AAs與高血壓病尤其是先兆子癇密切相關(guān)，并可以用于預(yù)測(cè)先兆子癇患者的預(yù)后結(jié)局。我們首次在大規(guī)模的血壓正常人群中對(duì)這兩種抗體進(jìn)行了檢測(cè)，雖然AT1-AAs和α1-AAs抗體同時(shí)存在人群較少（8.1%），但他們的動(dòng)脈硬化進(jìn)展和高血壓發(fā)病率均顯著的高于單抗陽(yáng)性或雙抗體陰性人群。我們推測(cè)AT1-AAs和α1-AAs分別模擬了AngⅡ和去甲腎上腺素激動(dòng)樣作用，因此導(dǎo)致兩個(gè)抗體均為陽(yáng)性人群的RAAS和交感系統(tǒng)被同時(shí)激活，最終造成了這部分人群心率顯著增加、血管重塑加劇以及心室重構(gòu)，最終導(dǎo)致動(dòng)脈硬化和高血壓顯著進(jìn)展。

本研究結(jié)果表明，AT1-AAs和α1-AAs這兩種自體抗體是血壓正常人群動(dòng)脈硬化進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在AT1-AAs和α1-AAs均為陽(yáng)性的研究對(duì)象中，原發(fā)性高血壓發(fā)病率及動(dòng)脈硬化進(jìn)展明顯增加。這兩種抗體來(lái)有可能作為動(dòng)脈硬化和高血壓的治療靶點(diǎn)，有待進(jìn)一步的研究。