崔秀玲 瞿敏 托景堂

滄州市中心醫(yī)院麻醉二科061001

機械通氣是救治危重癥患者及術(shù)中呼吸支持的重要手段,同時機械通氣還可導致肺損傷或加重原有的肺損傷稱為機械通氣相關(guān)性肺損傷[1]。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)是絲裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)家族重要成員之一,廣泛參與免疫反應、細胞分化和凋亡、胚胎發(fā)育等多種生理病理過程。有報道指出,JNK 信號通路參與了機械通氣相關(guān)性肺損傷的發(fā)生[2-3]。甲潑尼龍屬中效糖皮質(zhì)激素是治療各種炎性疾病的常用藥物,具有強大的抗炎及免疫抑制作用,能有效消除肺組織水腫,能減輕呼吸機相關(guān)性肺損傷[2]。本研究通過制備大鼠大潮氣量機械通氣急性肺損傷模型,觀察甲潑尼龍預處理對大鼠肺組織炎癥、水腫、細胞凋亡的影響,并探討其機制,為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物來源、分組及處理 清潔級雄性SD大鼠80只,購至河北省實驗動物中心,實驗動物合 格 證 號：SCXK(冀)2015-0007,批 號：37001800000321,體質(zhì)量250～300 g。所有大鼠均按照實驗動物管理和使用指南進行飼養(yǎng)和處理,于恒溫環(huán)境中飼養(yǎng),自由飲水和進食。實驗經(jīng)滄州市中心醫(yī)院倫理委員會核實批準。將80只大鼠采用隨機數(shù)字表法分為對照組(C 組)、機械通氣組(V 組)、甲潑尼龍(意大利Pfizer Manufacturing Belgium NV 公司)組(Mp組)、SP600125+甲潑尼龍組(SMp組),各20只。C 組不行機械通氣,自主呼吸空氣4 h；V 組、Mp組、SMp組大潮氣量機械通氣4 h,機械通氣前30 min,SP600125+甲潑尼龍組(SMp組)給予JNK 抑制劑SP600125(中國深圳晶美公司)30μg/100 g皮下注射；機械通氣前20 min,Mp組、SMp組分別靜脈輸注甲潑尼龍10 mg/kg；V組靜脈給予等容量0.9%氯化鈉。

1.2 觀察指標

1.2.1 氧合指數(shù)(oxygenation index,OI) 采集各組大鼠插管即刻及機械通氣1、2、4 h 時(T1-4)股動脈血樣0.2 ml采用i-STAT1 型血氣分析儀(美國雅培公司)行血氣分析,記錄PaO2并計算OI。OI=PaO2/FiO2。

1.2.2 支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中蛋白含量、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、巨噬細胞炎性蛋白-2(macrophage inflammatory protein-2,MIP-2)、肺通透指數(shù)(lung permeability index,LPI)及肺濕/干重(wet/dry weight,W/D) T4 時取各組大鼠股動脈血樣2 ml 4 ℃下3 000 r/min離心15 min,離心半徑7.9 cm,分離血清測定血漿蛋白濃度。取血后按照實驗動物倫理學要求經(jīng)動脈放血處死大鼠,開胸結(jié)扎大鼠右側(cè)肺門,采用4 ml生理鹽水灌洗左肺3 次,回收BALF,于4 ℃下1 500 r/min離心10 min,離心半徑15 cm,取上清液,-80 ℃保存。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linkedimmunosorbent assay,ELISA)檢測BALF中的TNF-α和MIP-2的濃度。采用考馬斯亮藍法檢測BALF 中蛋白含量。LPI=BALF 蛋白濃度/血漿蛋白濃度。取左肺下葉稱肺濕重,然后置于75℃干燥箱中48 h烤至恒重后稱干重,計算W/D。

1.2.3 髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)與細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1) 取出右肺中葉,迅速存于液氮中以備勻漿,按重量體積比1∶19加入緩沖液制備5%組織勻漿,測定肺組織MPO 活性。取肺組織切片,采用免疫組織化學法檢測ICAM-1的表達水平。

1.2.4 肺組織細胞凋亡指數(shù)(apoptotic index,AI) 采用TUNEL 法光鏡下隨機選取各組大鼠肺泡區(qū)10個高倍視野(×400),觀察細胞凋亡情況,計算AI,AI=凋亡陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.2.5 肺組織病理學觀察及肺泡損傷率(alveolar injury rate,AIR) 取各組大鼠右肺下葉組織左肺下葉約(1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm)組織,經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋、切片、HE 染色,光鏡下(×200)觀察肺組織病理學結(jié)果。光鏡下連續(xù)觀察200個肺泡計算AIR,即損傷肺泡計數(shù)占總肺泡計數(shù)的百分比。

1.2.6 RT-PCR法檢測肺組織JNK m RNA 表達 取大鼠右肺上葉組織100 mg,采用TRIzol法提取總 RNA,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Fermentas Life Science公司)行cDNA 擴增。采用primer 5.0軟件設計內(nèi)參β-actin 及JNK 引物。β-actin(產(chǎn)物片斷405 bp)：上游引物序列為5'-ATGGTATTCTTGCCTGAC-3',下游引物序列為 5'-AATGTACGTGGATACTGAG-3'； JNK(產(chǎn)物片斷400 bp)：上游引物序列為5'-AATCCTGAGCAAAGCTGAGAAC-3',下游引物系列為 5'-CGTACAAAACCAATCACGAGAA-3'。PCR反應條件：95 ℃、10 min,95 ℃、30 s,55 ℃、30 s,72 ℃、30 s,33個循環(huán)后72 ℃、10 min。4 ℃終止反應。采用Imager圖像分析儀測定各條帶吸光度值,以JNK 吸光度值與β-actin吸光度值之比代表JNK mRNA 的表達水平。

1.2.7 Western blotting 法檢測JNK、磷酸化JNK(p-JNK)表達 取各組大鼠右肺上葉組織100 mg,BCA 標準曲線法測定蛋白濃度,取40μg蛋白上樣經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜,室溫下用封閉液封閉2 h后加入一抗(美國Santa Cruz公司)兔抗大鼠p-JNK、JNK、β-actin稀釋度(1∶500),4 ℃過夜。次日洗膜后加入山羊抗兔二抗(中國北京中杉金橋生物科技有限公司)稀釋度(1∶500),室溫孵育1.5 h,再次洗膜后置于NBT/BCIP 顯色液避光顯色,掃描蛋白印記圖,采用Reveal型lmager圖像分析儀(美國Bio-Rad公司)進行半定量分析,以目的蛋白條帶吸光值比內(nèi)參β-actin條帶吸光值來反應目的蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0軟件包進行統(tǒng)計分析,計量資料以表示,組間比較采用單因素方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠OI比較 SMp組與V 組T3、T4時OI較 T1 時降低(F=12.16,P＜0.05)；V組與SMp 組 T3、T4 時 OI較 C 組降低(F=11.95,P＜0.05)；與V 組比較,Mp組與SMp組T3、T4時OI升高(F=10.86,P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠各時點OI比較(mm Hg,)

表1 各組大鼠各時點OI比較(mm Hg,)

注：1 mm Hg=0.133 kPa；C 組為對照組；V 組為機械通氣組；Mp組為甲潑尼龍組；SMp組為SP600125+甲潑尼龍組；OI為氧合指數(shù)；與T1時比較,F =12.16,a P ＜0.05；與C 組比較,F =11.95,b P ＜0.05；與 V 組比較,F =10.86,c P ＜0.05

組別 鼠數(shù) T1 T2 T3 T4 C組 20 585±33 565±25 561±31 553±25 V 組 20 583±32 503±28 251±13ab 213±11ab Mp組 20 581±29 574±33 559±21c 548±15c SMp組 20 586±34 521±26 271±14ab 224±13ab

2.2 各組大鼠 W/D、LPI、AIR、ICAM-1、MPO 比較 與C 組比較,V 組與SMp組肺組織W/D、LPI、AIR、ICAM-1、MPO 升 高(F=4.05、3.78、12.95、4.10、3.14,P值 均 ＜0.05),Mp組上述指標差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；與V 組比較,Mp組與SMp組肺組織 W/D、LPI、AIR、ICAM-1、MPO 降低(F=4.05、3.78、12.95、4.10、3.14,P值均＜0.05)；與Mp組比較,SMp 組肺組織 W/D、LPI、AIR、ICAM-1、MPO 升高(F=4.05、3.78、12.95、4.10、3.14,P值均＜0.05),見表2。

2.3 各組大鼠BALF 中總蛋白、TNF-α、MIP-2濃度的比較 與C 組比較,V 組與SMp組BALF中總蛋白、TNF-α、MIP-2 升高(F=19.45、13.68、12.53,P值均＜0.05),Mp組上述指標差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；與V 組比較,Mp組與SMp組BALF 中總蛋白、TNF-α、MIP-2濃度降低(F=19.45、13.68、12.53,P值均＜0.05)；與Mp組比較,SMp組BALF 中總蛋白、TNF-α、MIP-2 濃度升高(F=19.45、13.68、12.53,P值均＜0.05),見表3。

2.4 各組大鼠肺組織病理學觀察結(jié)果 光鏡下C組肺組織形態(tài)正常,肺泡完整,肺泡腔無滲出及出血,肺間質(zhì)未見增厚水腫,罕見中性粒細胞。V 組肺泡結(jié)構(gòu)紊亂,肺間質(zhì)水腫,肺泡間隔增厚,肺泡內(nèi)出血、水腫、紅細胞漏出、炎性細胞浸潤。Mp組較V 組病理損傷減輕,肺泡形態(tài)正常,肺泡間隔輕微增厚,肺間質(zhì)輕度水腫,肺泡腔無明顯出血及滲出,罕見中性粒細胞。SMp組肺損傷介于V組與Mp組之間。見圖1。

表2 各組大鼠W/D、LPI、AIR、ICAM-1、MPO 的比較()

表2 各組大鼠W/D、LPI、AIR、ICAM-1、MPO 的比較()

注:C組為對照組；V 組為機械通氣組；Mp組為甲潑尼龍組；SMp組為SP600125+甲潑尼龍組；W/D 為濕/干比值；LPI為肺通透指數(shù)；AIR 為肺泡損傷率；ICAM-1為細胞間黏附分子-1；MPO 為髓過氧化物酶；與C組比較，a P ＜0.05；與V 組比較,b P ＜0.05；與Mp組比較,c P ＜0.05

組別 鼠數(shù) W/D LPI(×10-3) AIR(%) ICAM-1(μg/L) MPO(U/g)C組 20 4.58±0.21 2.17±0.24 14.88±3.22 1.75±0.21 0.84±0.86 V 組 20 8.73±0.37a 5.41±0.51a 41.93±8.17a 6.48±1.51a 1.95±0.16a Mp組 20 4.74±0.21b 2.37±0.17b 15.75±3.44b 2.15±0.51b 0.89±0.95b SMp組 20 5.87±0.29abc 4.04±0.31abc 28.77±5.45abc 4.13±0.92abc 1.21±0.12abc F 值 4.05 3.78 12.95 4.10 3.14 P 值 0.01 0.02 0.00 0.01 0.02

表3 各組大鼠BALF中總蛋白、TNF-α、MIP-2濃度的比較()

表3 各組大鼠BALF中總蛋白、TNF-α、MIP-2濃度的比較()

注:C組為對照組；V 組為機械通氣組；Mp組為甲潑尼龍組；SMp組為SP600125+甲潑尼龍組；BALF 為支氣管肺泡灌洗液；TNF-α為腫瘤壞死因子-α；MIP-2為巨噬細胞炎性蛋白-2；與C組比較，a P ＜0.05；與 V 組比較,b P ＜0.05；與 Mp組比較,c P ＜0.05

組別 鼠數(shù) 總蛋白(mg/L) TNF-α(ng/L) MIP-2(ng/L)C組 20 335.12±24.5 74.36±4.21 138.85±19.32 V組 20 759.23±49.13a 152.39±9.19a 436.65±31.52a Mp組 20 359.36±28.25b 81.85±8.31b 146.39±26.22b SMp組 20 489.39±33.43abc 118.72±5.31abc 284.62±18.36abc F 值 19.45 13.68 12.53 P 值 0.00 0.00 0.00

2.5 各組大鼠肺組織JNK、p-JNK 蛋白及JNK m RNA 表達比較 4組大鼠肺組織JNK 表達水平差異無統(tǒng)計學意義(F=1.13,P＞0.05)；與C組比較,V 組和 SMp 組肺組織 p-JNK 和JNK m RNA 表達上調(diào)(F=3.78、3.29,P值均＜0.05),Mp組上述指標差異無統(tǒng)計學意義(F=3.78、3.29,P值均＞0.05)；與 V 組比較,Mp組與SMp組肺組織p-JNK 和JNK m RNA 表達下調(diào)(F=3.78、3.29,P值均＜0.05)；與 Mp組比較,SMp組肺組織p-JNK 和JNK m RNA 表達下調(diào)(F=3.78、3.29,P值均＜0.05),見表4、圖2。

圖1 肺組織病理學變化 HE ×200 A：對照組；B：機械通氣組；C：甲潑尼龍組；D：SP600125+甲潑尼龍組

表4 各組大鼠肺組織JNK、p-JNK 蛋白及JNK m RNA 表達比較()

表4 各組大鼠肺組織JNK、p-JNK 蛋白及JNK m RNA 表達比較()

注:C組為對照組；V 組為機械通氣組；Mp組為甲潑尼龍組；SMp組為SP600125+甲潑尼龍組；JNK 為c-Jun 氨基末端激酶；p-JNK為磷酸化JNK；與C組比較，a P ＜0.05；與V 組比較,b P ＜0.05；與Mp組比較,c P ＜0.05

組別 鼠數(shù) JNK p-JNK JNK m RNA C組 20 0.73±0.04 1.04±0.15 0.38±0.03 V 組 20 0.75±0.07 2.91±0.44a 0.99±0.13a Mp組 20 0.71±0.05 1.25±0.22b 0.42±0.06b SMp組 20 0.78±0.09 1.96±0.31abc 0.71±0.09abc F 值 1.13 3.78 3.29 P 值 0.56 0.01 0.02

圖2 各組大鼠肺組織JNK、p-JNK 表達水平

2.6 各組大鼠肺組織TUNEL 檢測結(jié)果比較 C組未出現(xiàn)明顯細胞凋亡,V 組TUNEL 陽性細胞表達明顯增加,Mp組TUNEL陽性細胞表達明顯降低,SMp組TUNEL陽性細胞表達介于V 組與Mp組之間。見圖3。

3 討論

一方面過度機械通氣可直接造成肺組織發(fā)生機械損傷[4-8],另一方面還介導肺組織發(fā)生以炎性細胞浸潤、細胞因子表達增加等改變的生物學損傷[9-11]。W/D、LPI 可反映肺組織的水腫情況,MPO 是由中性粒細胞分泌的血紅素蛋白酶,其活性反映組織中性粒細胞激活程度[12]；ICAM-1 可促進白細胞黏附、扣押于肺泡區(qū)域,導致肺實質(zhì)細胞損傷及持續(xù)細胞因子釋放[13-14]；BALF中總蛋白濃度、TNF-α和MIP-2濃度反應肺組織炎癥反應程度[15]。

本研究結(jié)果顯示,隨著機械通氣時間的延長V組大鼠OI逐漸下降,T4時與C 組比較,V 組大鼠AI、W/D、AIR、LPI均明顯升高,BALF 中總蛋白濃度、TNF-α和MIP-2濃度升高,MPO 與ICAM-1表達升高,肺組織病理損傷較重,細胞凋亡顯著增加,提示大鼠大潮氣量機械通氣相關(guān)性肺損傷模型制備成功。本研究參照文獻[16]并結(jié)合預實驗結(jié)果選擇甲潑尼龍的劑量與用法,依據(jù)文獻[17]選擇SP600125 的劑量與用法。研究結(jié)果顯示,與V 組比較,Mp組隨著機械通氣時間的延長OI逐漸升高,T4時肺組織AIR、LPI、W/D、AI均降低,光鏡下示肺組織病理學損傷減輕,TUNEL法示細胞凋亡減少,與Mp組比較,SMp組肺損傷較重。該結(jié)果提示甲潑尼龍具有肺保護作用,JNK 信號通路抑制劑一定程度上可逆轉(zhuǎn)甲潑尼龍的肺保護作用。

MAPK 屬于絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶類,主要位于真核細胞細胞質(zhì)中,可將細胞外刺激信號傳遞到細胞核,可介導細胞間信息傳遞,在增殖、分化、轉(zhuǎn)化、炎癥以及凋亡等多種細胞過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。 MAPK 有20多種亞型,如p38MAPK、JNK、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extra cellular signal-regulated kinase,ERK)1/2、ERK5等。多種刺激可使MAPK 中的蘇氨酸和酪氨酸殘基磷酸化而活化MAPK[18],在被激活后,ERK 具有抗凋亡作用,JNK 和p38則具有促進炎癥及凋亡作用。

圖3 各組大鼠肺組織TUNEL 陽性細胞表達水平 TUNEL ×400 A：對照組；B：機械通氣組；C：甲潑尼龍組；D：SP600125+甲潑尼龍組

大潮氣量機械通氣時肺組織細胞表面產(chǎn)生了過度的機械刺激,肺組織上皮細胞受到機械刺激后可使JNK 的蘇氨酸和酪氨酸殘基磷酸化進而激活JNK 通路,誘發(fā)相關(guān)炎性因子的合成與釋放加重肺損傷[3]。本研究也得出相同的結(jié)果,V 組大鼠p-JNK 和JNK m RNA 表達明顯高于C組。有研究顯示,糖皮質(zhì)激素可通過上調(diào)絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶1表達來抑制JNK 信號通路活化,減少相關(guān)炎性因子的表達,減輕肺損傷[19-20]。我們的前期研究也同樣發(fā)現(xiàn)甲潑尼龍可減輕大鼠機械通氣相關(guān)性肺損傷與其抑制p38MAPK 磷酸化有關(guān)[21-23]。本研究結(jié)果顯示,甲潑尼龍可下調(diào)大鼠肺組織p-JNK 和JNK mRNA 表達,可使肺損傷明顯減輕,預先給予JNK 抑制劑SP600125皮下注射后甲潑尼龍的肺保護作用下降,該結(jié)果提示甲潑尼龍可通過抑制JNK 磷酸化來減輕大鼠機械通氣相關(guān)性肺損傷,既往文獻[19]報道支持該結(jié)果。

本研究中與V 組比較SMp組隨機械通氣時間的延長OI逐漸升高,T4 時肺組織LPI、W/D、AI、AIR 均降低,肺組織細胞凋亡減少,病理學損傷減輕,該結(jié)果提示SP600125并未完全逆轉(zhuǎn)甲潑尼龍的肺保護作用,提示在JNK 信號通路以外還有別的信號通路參與了甲潑尼龍的肺保護作用。

綜上所述,甲潑尼龍可通過抑制肺組織JNK磷酸化來減輕大鼠機械通氣相關(guān)性肺損傷。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突