尚淑娜 - 生 威 王璐璐 - 趙秋霞 - 王 碩 o

(1. 食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室〔天津科技大學(xué)〕，天津 300457；2. 天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

鄰苯二甲酸酯(PAEs)類塑化劑主要添加在塑料中，用來提高其柔軟度及延展性[1-2]，產(chǎn)量大、種類多，廣泛存在于食品容器、玩具、乙烯基涂料、油漆和香水中[3]。鄰苯二甲酸酯類塑化劑與塑料基質(zhì)不以化學(xué)鍵結(jié)合，隨著時間、溫度和pH值等的影響，它會從塑料制品中不斷遷移到環(huán)境或食品中，進(jìn)而進(jìn)入人體[4]。

鄰苯二甲酸酯類塑化劑穩(wěn)定性高，具有生物富集作用和雌激素效應(yīng)，會干擾機體內(nèi)正常的激素水平，可能會引起生殖系統(tǒng)異常致畸、致癌等。此外，鄰苯二甲酸酯類塑化劑不易降解，會對環(huán)境造成污染，已成為全球普遍的污染物之一[5-7]。鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)是鄰苯二甲酸酯類塑化劑中應(yīng)用最廣泛的一種，最容易從塑料包裝膜中向被包裝食品遷移，具有肝臟毒性和生殖毒性，會引發(fā)動物肝臟病變和精子畸變率增高[8-9]。中國2016年發(fā)布的GB 9685—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品接觸材料及制品用添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》，要求鄰苯二甲酸二丁酯生產(chǎn)的材料或制品不得用于接觸脂肪性、乙醇含量高于20%的食品以及嬰幼兒食品，最大殘留量和特定遷移限量為0.3 mg/kg。GB 6675.1—2014中規(guī)定兒童玩具和兒童護(hù)理產(chǎn)品中鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸丁基芐酯(BBP)和鄰苯二甲酸(2-乙基)己酯(DEHP)物質(zhì)含量的總和不得超過0.1%。

對于鄰苯二甲酸酯的檢測，目前主要采用氣相色譜法[10-12]、氣相色譜—質(zhì)譜法[13-14]、液相色譜法[15-16]、液相色譜—質(zhì)譜法[17]等。這些儀器檢測方法前處理過程較為繁瑣，且儀器昂貴、耗時長、操作過程復(fù)雜，不適于樣品的現(xiàn)場分析和大量樣品的檢測。相比較儀器方法而言，免疫分析方法具有靈敏度高、特異性好、成本低和易操作等特點。本研究擬以鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)為研究對象，以4-氨基鄰苯二甲酸為原料，通過酯化反應(yīng)合成半抗原4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯(DBAP)，利用重氮化法合成免疫原，得到抗鄰苯二甲酸二丁酯的抗體，進(jìn)而建立間接競爭ELISA方法，用于檢測食品中的鄰苯二甲酸二丁酯。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

4-氨基鄰苯二甲酸：純度95%，薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司；

正丁醇、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、脫脂乳粉、乙酸乙酯、石油醚、甲醇：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑：美國Sigma公司；

雄性新西蘭大白兔：3月齡，體重1.5 kg，北京興隆實驗動物養(yǎng)殖場。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

超純水系統(tǒng)：Milli-Q Integral型，美國MILLIPORE公司；

洗板機：MTS 2/4 digital型，美國BIO-RAD公司；

酶標(biāo)儀：F200 PRO型，美國Thermo公司；

蛋白純化儀：731-8300型，美國BIO-RAD公司；

分析天平：BL610型，賽多利斯儀器(北京)系統(tǒng)有限公司；

紫外分光光度計：Evolution 300型，美國Varian公司；

氣質(zhì)聯(lián)用儀：4000MS型，美國Varian公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯(DBAP)的合成與鑒定

(1) 將4.5 g 4-氨基鄰苯二甲酸加入到15 mL正丁醇中，超聲20 min，在攪拌條件下緩慢加入濃硫酸至液體呈透明，120 ℃回流反應(yīng)6～7 h。

(2) 減壓蒸餾除去未反應(yīng)的正丁醇和水2～3 h，反應(yīng)完成后趁熱倒入冰水中，用乙酸乙酯萃取水層，并用10%的Na2CO3調(diào)節(jié)pH至堿性，用分液漏斗分離，重復(fù)萃取，合并萃取液，旋蒸去除乙酸乙酯，得淺黃色固體。

(3) 將得到的淺黃色固體用硅膠板進(jìn)行純化。展開劑為體積比1∶3的乙酸乙酯—石油醚混合液，將所需要的條帶刮下后加入乙酸乙酯浸泡、渦旋振蕩，離心后，取有機相過0.22 μm有機膜，重復(fù)幾遍后，合并所得到的有機相，旋蒸，最終得到淡黃色的固體，然后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

1.2.2 人工抗原的合成與鑒定 取1.17 mg 4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯(DBAP)溶解于100 μL的DMF，加入到1 mL 0.1 mol/L預(yù)冷鹽酸中，置冰浴中攪拌；逐滴加入1 mol/L 的NaNO2溶液(5～10 μL)至淀粉碘化鉀試紙變成深紫色，繼續(xù)避光攪拌30 min，加入尿素，使試紙不再顯色；將20 mg KLH用2 mL碳酸鈉緩沖液(pH=9.5)溶解，緩慢加入到上述重氮鹽中，加入1 mol/L的氫氧化鈉溶液，使溶液pH值維持在9.0～9.5，溶液逐漸變?yōu)槌燃t色。在4 ℃下避光攪拌反應(yīng)3 h，PBS透析3 d，得到免疫抗原(DBAP-KLH)。同樣按上述方法制得包被抗原(DBAP-BSA)。

用紫外分光光度法觀察DBAP-KLH/BSA，DBAP和載體蛋白 KLH/BSA的特征吸收峰的變化情況，鑒定人工抗原是否成功偶聯(lián)。

1.2.3 抗體制備與純化 選取體重約1.5 kg的新西蘭大白兔(3個月)，采用皮下多點注射方式制備抗體。將等量的免疫原和弗氏完全佐劑乳化后進(jìn)行初次免疫，在之后的加強免疫中使用弗氏不完全佐劑代替弗氏完全佐劑。每次免疫后7～8 d，耳靜脈采血進(jìn)行抗血清效價及特異性測定，在最后一次免疫后的8～10 d取全血，8 000 r/min 離心后分裝凍存在-20 ℃冰箱，使用Protein A-Sepharose 4B柱對兔抗血清進(jìn)行純化，制得多克隆抗體。

1.2.4 間接競爭ELISA方法檢測步驟 將DBAP-BSA包被抗原用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋至一定濃度后，96孔酶標(biāo)板每只孔中加入100 μL，4 ℃過夜(12～14 h)或37 ℃放置3 h，洗板3次，在濾紙上拍干；每孔加入200 μL 封閉液，37 ℃放置1 h，洗板3次，拍干；加入50 μL DBP標(biāo)準(zhǔn)溶液或者待測樣品和50 μL一定稀釋倍數(shù)的抗體，37 ℃孵育1 h，洗板4次，拍干；加入100 μL/孔酶標(biāo)二抗(HRP-羊抗兔IgG)，37 ℃ 孵育30 min，洗板5次，拍干；每孔加入100 μL的底物顯色液，37 ℃孵育10～20 min，加入終止液50 μL。用酶標(biāo)儀測定其在450 nm 下的吸光度值。

1.2.5 間接競爭ELISA方法條件優(yōu)化

(1) 包被量及抗體稀釋倍數(shù)的優(yōu)化：選取0.01，0.05，0.10，0.50 μg/孔的包被量和不同的抗體稀釋倍數(shù)組合進(jìn)行間接競爭ELISA方法的建立，計算不同包被量下的抗體稀釋倍數(shù)分別對應(yīng)的IC50值。選取OD450值在1左右并且IC50值最小的組合作為最優(yōu)的條件，進(jìn)行后續(xù)試驗。

(2) 封閉液的優(yōu)化：選取0.50%脫脂乳粉、1.00%脫脂乳粉、0.50% OVA和1.00% OVA作為封閉液進(jìn)行間接競爭ELISA方法的建立，分別計算IC50值，確定OD450在1左右且IC50值最小的作為最適封閉液。

(3) 鄰苯二甲酸二丁酯多克隆抗體間接競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：在最佳條件下，將鄰苯二甲酸二丁酯標(biāo)準(zhǔn)品從5 000 μg/L開始，以3倍梯度稀釋10個濃度梯度，進(jìn)行間接競爭ELISA測定，以鄰苯二甲酸二丁酯標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，用Origin 9.1繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行擬合，并計算IC50和IC15的值。

1.2.6 特異性測定 選取鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二乙酯、鄰苯二甲酸二丙酯、鄰苯二甲酸二異丁酯等18種鄰苯二甲酸二丁酯的結(jié)構(gòu)類似物進(jìn)行交叉反應(yīng)的測定，以評估鄰苯二甲酸二丁酯抗體的特異性，交叉反應(yīng)率(CR)越小，則說明抗體對該目標(biāo)物的特異性越高，CR按式(1)計算：

(1)

式中：

CR——交叉反應(yīng)率，%；

IC50(DBP)——抑制率為50%時所對應(yīng)的DBP的濃度，μg/L；

IC50(結(jié)構(gòu)類似物)——抑制率為50%時所對應(yīng)的DBP結(jié)構(gòu)類似物的濃度，μg/L。

1.2.7 樣品處理

(1) 白酒：取2 mL白酒樣品，用PBS稀釋3倍后用于檢測。

(2) 牛奶：取2 mL牛奶樣品，加入3%的三氯乙酸，沉降牛奶中的蛋白質(zhì)，6 000 r/min離心10 min，取上清液，加入1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至中性，用PBS稀釋2倍后用于檢測。

(3) 食用油：稱取1.0 g食用油樣品，加入5 mL乙腈，渦旋1 min，4 000 r/min離心2 min，收集上清液，重復(fù)提取1遍，將2次收集的上清液混合，旋蒸至干，加入2 mL 甲醇混合后在-20 ℃下冷凍2 h，4 000 r/min離心2 min，取上清液濃縮至近干，加入2 mL含5%甲醇的PBS樣本稀釋液復(fù)溶[18]。

1.2.8 添加回收率的測定 在選取的樣品中分別添加0，10，20，50，100 μg/L濃度的DBP標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度做3個平行，按1.2.7中方法進(jìn)行樣品的處理，進(jìn)行間接競爭ELISA的測定，計算回收率。

1.2.9 氣相色譜—質(zhì)譜法儀器方法驗證 參考GB 5009.271—2016，選用GC-MS(氣相色譜—質(zhì)譜法)對本試驗建立的方法進(jìn)行驗證，確定方法的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯的合成與鑒定

合成的半抗原DBAP的分子量為293，由圖1可以看出其負(fù)離子(MS-1)為292.23，與其分子量相符，可以證明半抗原DBAP合成成功。

圖1 半抗原DBAP的表征質(zhì)譜圖

2.2 人工抗原的紫外鑒定

用紫外分光光度計對半抗原、載體蛋白和偶聯(lián)物進(jìn)行測定，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出：KLH與BSA蛋白在紫外下的吸收波長為280 nm，半抗原DBAP在285 nm左右有特征吸收峰，半抗原與蛋白質(zhì)偶聯(lián)物DBAP-BSA和DBAP-KLH的特征吸收峰與KLH和BSA蛋白相比發(fā)生了明顯的改變，說明人工免疫抗原與包被抗原制備成功。

圖2 DBP、KLH/BSA、DBAP-KLH/BSA紫外可見光譜

2.3 間接競爭ELISA方法條件優(yōu)化

2.3.1 包被量及抗體稀釋倍數(shù)的優(yōu)化 由表1可以看出：包被量一定時，隨著抗體稀釋倍數(shù)增加，OD450值降低，IC50值呈下降趨勢；比較不同包被量的IC50值和OD450值，當(dāng)包被量為0.05 μg/孔，抗體稀釋倍數(shù)為5 000時，IC50值較低，且其OD450值在1左右。因此選擇包被量為0.05 μg/孔，抗體稀釋倍數(shù)為5 000作為最優(yōu)條件進(jìn)行試驗。

表1 包被量及抗體稀釋倍數(shù)的優(yōu)化

2.3.2 封閉液的優(yōu)化 由圖3可知：封閉液的種類會對OD450和IC50值產(chǎn)生影響。當(dāng)選用0.50%的脫脂乳粉作為封閉液時，所得到的IC50值最低，并且OD450值在1左右，故選用0.50%的脫脂乳粉作為封閉液進(jìn)行試驗。

圖3 封閉液的優(yōu)化

2.3.3 鄰苯二甲酸二丁酯多克隆抗體間接競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 根據(jù)優(yōu)化的條件，選用0.05 μg/孔的包被量，5 000倍的抗體稀釋倍數(shù)，0.50%的脫脂乳粉作為封閉液，2萬倍的二抗稀釋倍數(shù)，DBP標(biāo)準(zhǔn)品從5 000 μg/L 開始進(jìn)行3倍梯度稀釋，顯色15 min左右，建立間接競爭ELISA方法，得出目標(biāo)物DBP的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示。由圖4可知：方法的靈敏度(IC50)和檢測限(IC15)分別是(40.68±0.35) μg/L和(1.98±0.15) μg/L。

2.4 特異性測定

用間接競爭ELISA方法對鄰苯二甲酸二丁酯的結(jié)構(gòu)類似物進(jìn)行特異性檢測，結(jié)果如表2所示。

圖4 DBP間接競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

測試集編號主成分回歸R2RMSE偏最小二乘回歸R2RMSE10.888 20.149 60.911 10.139 720.893 10.145 50.906 10.141 330.896 10.148 80.901 40.141 7

由表2可以看出：所制備的抗體與DPRP、DIBP和BBP有較低的交叉反應(yīng)，交叉率都低于10%?？赡苁且驗樗鼈兊慕Y(jié)構(gòu)較為相似，與其他結(jié)構(gòu)類似物都無交叉反應(yīng)。因此，鄰苯二甲酸二丁酯的結(jié)構(gòu)類似物對本方法的建立無影響，所獲得的鄰苯二甲酸二丁酯抗體特異性較好。

2.5 樣品的測定

在白酒、牛奶、食用油樣品中，分別添加0，10，20，50，100 μg/L濃度的鄰苯二甲酸二丁酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度做3個平行，處理后進(jìn)行間接競爭ELISA的測定，結(jié)果如表3所示。由表3可以得知：添加回收率在84.57%～102.40%。同時，采用氣相色譜—質(zhì)譜法(GC-MS)對間接競爭ELISA方法進(jìn)行驗證，線性方程為：y=31 355x+184 546，R2=0.999 8，添加回收率在85.14%～96.83%。將兩種方法進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見圖5。由圖5可知：兩種方法具有良好的相關(guān)性(R2=0.990 8)，證明本試驗所建立的間接競爭ELISA方法較為準(zhǔn)確，可以對白酒、牛奶、食用油中的鄰苯二甲酸二丁酯進(jìn)行檢測。

表3 ELISA和GC-MS添加回收結(jié)果

Table 3 The recovery results of ELISA and GC-MS (n=3)

圖5 ELISA和GC-MS檢測結(jié)果相關(guān)性

3 結(jié)論

本試驗直接將4-氨基鄰苯二甲酸作為合成原料，通過酯化反應(yīng)合成半抗原4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯，與之前文獻(xiàn)[19-20]報道的合成步驟相比，無需經(jīng)過4-硝基鄰苯二甲酸二丁酯的硝基還原，整個合成過程更簡單。試驗建立的間接競爭ELISA方法的IC50值為40.68 μg/L，最低檢測限IC15為1.98 μg/L，對鄰苯二甲酸二丁酯具有較好的特異性。樣品中鄰苯二甲酸二丁酯的檢測結(jié)果與GC-MS測定結(jié)果有較好的一致性(R2=0.990 8)，證明該方法具有很好的準(zhǔn)確性，可以用于食品中鄰苯二甲酸二丁酯的檢測。本研究方法的靈敏度還不夠高，今后可以借助新型熒光標(biāo)記材料建立新方法提高檢測靈敏度。