王犁燁 - 王浩臣 - 馬 珊 劉維兵 - 李澤涵 -宋晶晶 - 楊華峰 - 張 穎 武 運

(1. 新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2. 新疆維吾爾自治區(qū)科技項目服務中心，新疆 烏魯木齊 830011；3. 新疆儀爾高新農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，新疆 焉耆 841000；4. 吐魯番市質(zhì)量與計量檢測所，新疆 吐魯番 838000)

隨著消費者對飲食健康及養(yǎng)生關注度的不斷加深，中國葡萄酒的需求量逐年增長，釀酒工業(yè)呈現(xiàn)快速發(fā)展態(tài)勢[1]。新疆作為中國最古老的葡萄種植產(chǎn)區(qū)，地區(qū)生態(tài)環(huán)境獨特，區(qū)位優(yōu)勢明顯，是發(fā)展釀酒葡萄的理想產(chǎn)區(qū)[2]。但該地日溫差大、降雨量少，使得釀酒葡萄原料具有糖高酸低的特點，酸度過低會使葡萄酒顏色黯淡無光，口感單調(diào)、不清新，直接影響到新疆地區(qū)葡萄酒的品質(zhì)[3-5]，因此需要選育高產(chǎn)酸的酵母菌株進行發(fā)酵，改善葡萄酒酸度低的現(xiàn)狀。

目前，通常采用傳統(tǒng)分離篩選的方法從自然界中篩選釀酒酵母菌株，但分離得到的野生菌株在發(fā)酵性能和功能上都具有一定的局限性。因此需要對已知菌株進行誘變，從基因?qū)用嫔细淖兘湍妇男再|(zhì)及功能，從而達到生產(chǎn)需要[6-8]。傳統(tǒng)的誘變方法操作復雜，對人體和環(huán)境存在一定的危害，新型常壓室溫等離子體(ARTP)生物誘變育種技術，因其操作簡單，對人體環(huán)境無毒無害，已成為生物誘變育種領域的一個研究熱點[9-11]。趙宇等[12]、曲文娟等[13]、秦艷飛等[14]采用ARTP對高核酸釀酒酵母、產(chǎn)蛋白酶菌株以及產(chǎn)恩拉霉素菌株進行處理，獲得生產(chǎn)所需的誘變菌株，但目前還沒有學者通過ARTP篩選高產(chǎn)酒精和酸的釀酒酵母。

本試驗擬以從葡萄表面篩選的Y6菌株為出發(fā)菌，通過ARTP誘變對其功能進行改造，以期獲得高產(chǎn)酒精及酸且發(fā)酵性能穩(wěn)定的目標釀酒酵母菌株，通過微生物代謝來增加葡萄酒的酒精度和酸度，以提高新疆葡萄酒品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

酵母菌株Y6：新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院微生物實驗室提供；

酵母浸粉、蛋白胨、瓊脂粉：北京奧博星生物技術有限責任公司；

葡萄糖、無水乙醇、：分析純，天津市致遠化學試劑有限公司；

2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetra-zolium chloride，TTC)：分析純，上海藍季生物科技發(fā)展有限公司；

溴甲酚綠：分析純，天津市北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司；

馬鈴薯葡萄糖瓊脂：青島高科園海博生物技術有限公司；

磷酸二氫鉀、硫酸鎂(MgSO4·7H2O)：分析純，天津市光復科技發(fā)展有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose medium, YPD)：20 g葡萄糖+20 g蛋白胨+10 g酵母浸粉+20 g瓊脂+1 000 mL 蒸餾水；

TTC上層培養(yǎng)基：0.05 g TTC+0.5 g 葡萄糖+2 g 瓊脂+100 mL 蒸餾水；

TTC下層培養(yǎng)基：10 g 葡萄糖+2 g 蛋白胨+ 5 g 酵母浸粉+1 g KH2PO4+0.4 g MgSO4·7H2O+20 g 瓊脂+1 000 mL 蒸餾水，調(diào)pH為5.5～5.7；

溴甲酚綠培養(yǎng)基：PDA基礎培養(yǎng)基+0.01%溴甲酚綠，調(diào)pH為 6.0。

1.1.3 儀器與設備

常壓室溫等離子誘變儀：ⅡS型，無錫源清天木生物科技有限公司；

分析天平：FA2014N型，北京東南儀誠實驗室設備有限公司；

立式高壓滅菌器：LDZX-50KBS型，上海申安醫(yī)療器械廠；

生物安全柜：HR40-A2型，青島海爾特種電器有限公司；

霉菌培養(yǎng)箱：MJX-160-Z型，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；

紫外可見光光度計：TU-1810型，北京普析通用儀器有限責任公司；

PH計：FE20 PLUS型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

手持糖度計：PAL-1型，北京陽光億事達科技有限公司；

漩渦混合器：VORTEX-5型，華利達實驗設備有限公司；

離心機：SF-TDL-6A型，上海菲恰爾分析儀器有限公司；

葡萄酒全自動檢測儀：Y15型，西班牙Biosystem公司。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備 首先挑取一環(huán)存放于冰箱的Y6酵母菌接種于YPD液體培養(yǎng)基中，在28 ℃下培養(yǎng)24 h；然后將菌液以2%的接種量接入新配的YPD液體培養(yǎng)基中，在28 ℃下培養(yǎng)24 h后，制得菌懸液。

1.2.2 Y6酵母生長曲線的測定 將活化好的Y6菌液以5%的接種量接種到YPD液體培養(yǎng)基中，在28 ℃下培養(yǎng)，每間隔2 h取1次樣，在波長600 nm測吸光值，以空白培養(yǎng)基為對照，根據(jù)測得的吸光值繪制Y6酵母的生長曲線，確定Y6酵母的生長對數(shù)期。

1.2.3 ARTP誘變試驗 試驗參數(shù)：選擇純度為99.999% 的氦氣作為工作氣體，流量為10 SLM，電源功率設定為120 W，操作溫度20 ℃，處理時間分別為0，20，40，60，80，100，120，140 s。誘變試驗：在超凈工作臺中吸取1 mL 在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期的出發(fā)菌株Y6的菌液，在3 000 r/min 離心10 min，棄上清液，用無菌生理鹽水洗滌3次后吸取10 μL放在載片上，用無菌鑷子將載片依次放在對應的凹槽中，并將裝有1 mL YPD液體培養(yǎng)基的EP管固定在下方，即可進行誘變試驗，誘變后將裝有載片的EP管放在漩渦器上劇烈震蕩1 min，將誘變菌洗脫下來，梯度稀釋10-6～10-7后，吸取100 μL涂布在平板上，在28 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)48 h，計算致死率，選擇最佳誘變時間。

1.2.4 致死率計算

(1)

式中：

Z——菌株的致死率，%；

X1——ARTP誘變后的菌落數(shù)；

X——對照組的菌落數(shù)。

1.2.5 高產(chǎn)酒精及酸釀酒酵母初篩

(1) TTC培養(yǎng)基篩選：采用劃線法將挑選出的突變菌株接種于TTC下層培養(yǎng)基中，在28 ℃條件下培養(yǎng)48 h 后，在TTC下層培養(yǎng)基上覆蓋一層TTC上層培養(yǎng)基，并于28 ℃的條件下培養(yǎng)3 h，觀察培養(yǎng)皿中的顯色情況，從中篩選出產(chǎn)酒精能力強的突變菌株。

(2) 溴甲酚綠培養(yǎng)基篩選：先在培養(yǎng)皿中倒入一層剛好可以覆蓋培養(yǎng)皿底部的溴甲酚綠培養(yǎng)基，待其凝固后放入牛津杯，再在牛津杯外圍倒入一層溴甲酚綠培養(yǎng)基，培養(yǎng)基凝固后取出牛津杯，將TTC培養(yǎng)基篩選出的顏色較深的酵母菌株進行活化，將吸取100 μL 菌液環(huán)接種于牛津杯空洞內(nèi)，在28 ℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察黃色圈，選擇菌落周圍出現(xiàn)較大黃色圈的菌株進行發(fā)酵能力試驗。

(3) 菌株發(fā)酵能力測試：兩步篩選出的突變酵母菌株，以5%的接種量分別接種于裝有10 mL YPD液體培養(yǎng)基的試管中后，放入杜氏小管，并確保杜氏小管內(nèi)無氣泡，在28 ℃的條件下培養(yǎng)，每12 h觀察一次突變菌株產(chǎn)氣情況，記錄杜氏小管內(nèi)的填充度。根據(jù)試驗結果，篩選出發(fā)酵性能好，起酵快、生長旺盛的菌株。

1.2.6 高產(chǎn)酒精及釀酒酵母的復篩 將葡萄汁115 ℃，滅菌20 min，分裝在5個三角瓶中，每瓶150 mL，測定葡萄汁的糖度為23.6 Brix，總酸為4.94 g/L。將上幾步篩選的誘變菌株和出發(fā)菌株同時以5% 的接種量接種于葡萄汁中，在25 ℃條件下培養(yǎng)10 d，測定菌株產(chǎn)酒精和產(chǎn)酸能力，確定目標菌株。

1.2.7 遺傳穩(wěn)定性試驗 將突變酵母菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)5次，將每一代菌株以5%的接種量接種于糖度為22.8 Brix，總酸為5.32 g/L的葡萄汁中，在28 ℃條件下培養(yǎng)10 d，測定突變菌株的產(chǎn)酒精和產(chǎn)酸能力，從而驗證菌株的突變性能是否能夠穩(wěn)定遺傳。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)通過 Excel 2018 軟件及 Origin 8.5 軟件進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 Y6酵母菌生長曲線

酵母菌株所處的生理狀態(tài)在一定程度上影響了菌株誘變的效果，酵母菌處于對數(shù)生長期時，其個體之間的形態(tài)、化學組成和生理特性等基本一致，數(shù)目以穩(wěn)定的幾何指數(shù)增長且對環(huán)境因素的作用十分敏感[15-16]。因此，在此階段進行誘變，可以增加基因突變、穩(wěn)定遺傳的幾率[17]。如圖1所示，將Y6酵母菌接入液體培養(yǎng)基中，前4 h 酵母菌處于遲緩期，微生物的代謝系統(tǒng)需要適應新環(huán)境，因此數(shù)目增長緩慢。在4～16 h酵母菌數(shù)量增長迅速處于對數(shù)生長期，在16 h后酵母菌進入穩(wěn)定期，因此本試

圖1 Y6酵母菌生長曲線

驗選擇在10 h時對酵母菌進行誘變試驗。

2.2 最佳誘變時間的確定

誘變處理劑量或時間不僅影響致死率，同時影響突變效率，在一個合適的突變效率區(qū)間進行有效的篩選是菌種選育的關鍵之處[18]。如圖2所示，隨著常壓室溫等離子體處理時間的延長，Y6酵母的致死率急劇升高，當處理時間為100 s時，致死率達到98.7%，當處理時間為120 s 時，酵母菌無一存活，說明常壓室溫等離子體產(chǎn)生的活性粒子能夠破壞細胞結構，也能夠穿過細胞壁到達細胞內(nèi)打斷基因、蛋白質(zhì)分子等，從而導致大部分微生物死亡[19]，但當能量適中時，少數(shù)經(jīng)過ARTP照射的酵母菌會通過本身的自動修復系統(tǒng)進行修復，由于細胞中DNA的不完全修復可能會引起控制產(chǎn)生目標性狀功能的遺傳片段發(fā)生改變，從而導致性狀功能發(fā)生改變[20-21]。一般認為出發(fā)菌株穩(wěn)定時，選用致死率在90%以上菌株，以求得突變幅度較大的目標菌株[22]，因此試驗選擇處理時間為100 s，致死率為98.7%的誘變菌株。

2.3 高產(chǎn)酒精及酸釀酒酵母初篩

2.3.1 TTC培養(yǎng)基的篩選結果 TTC作為一種顯色劑，能對酵母的代謝產(chǎn)物發(fā)生顯色反應，并且通過反應顏色的深淺來判斷酵母中呼吸酶活力大小，從而判斷酵母產(chǎn)酒精能力的高低。通常情況下，產(chǎn)酒精能力越強的酵母菌株在TTC培養(yǎng)基上顯現(xiàn)的顏色越深。采用劃線法將39株誘變菌株接種到TTC培養(yǎng)基上，結果如表1所示，Y6-5、Y6-8、Y6-10、Y6-14、Y6-15、Y6-17、Y6-28、Y6-31、Y6-32、Y6-33、Y6-35，11株菌株顯色最為明顯，為深紅色，比出發(fā)菌Y6顯現(xiàn)的顏色更深，說明這11株酵母菌株在經(jīng)過等離子體處理后，產(chǎn)酒精能力有所增強。而Y6-3、Y6-6、Y6-11、Y6-27、Y6-34、Y6-39，這6株酵母菌都和出發(fā)菌Y6顯色一致，為紅色，但為了進一步了解株菌的產(chǎn)酸能力是否提高，將篩選出的11株深紅色酵母菌進行溴甲酚綠培養(yǎng)基篩選試驗。

圖2 處理時間對Y6酵母菌致死率的影響

2.3.2 溴甲酚綠培養(yǎng)基的篩選 溴甲酚綠一般被用作酸堿指示劑，當pH值在3.8時，顯現(xiàn)出黃色；當pH值在5.4時，顯現(xiàn)出藍綠色。將溴甲酚綠加入培養(yǎng)基中，可以判斷酵母菌株產(chǎn)酸能力的強弱。將TTC篩選出的17株菌株接種到溴甲酚綠培養(yǎng)基中，結果如表2所示，Y6-8、Y6-10、Y6-14、Y6-15、Y6-28、Y6-31、Y6-33這7株誘變菌株在溴甲酚綠培養(yǎng)基上的黃色圈均大于出發(fā)菌株Y6，可以初步判斷這7株突變菌株的產(chǎn)酸能力強于出發(fā)菌株。

表1 39株誘變酵母菌株TTC培養(yǎng)基篩選結果?

? “++++”表示深紅色；“+++”表示紅色；“++”表示粉色；“+”表示淺粉色；“-”表示無色。

表2 11株誘變酵母菌株溴甲酚綠培養(yǎng)基篩選結果

2.3.3 杜氏小管篩選 將上步篩選出的7株誘變菌株接種在裝有杜氏小管的試管中，當12 h時，菌株Y6-15和Y6-33的杜氏小管中產(chǎn)氣較多，其他誘變菌株均無明顯反應；當24 h時，菌株Y6-8中的杜氏小管充滿了氣體，并且杜氏小管浮在液面上，Y6-31和Y6-33與出發(fā)菌株Y6的產(chǎn)氣能力相同，在杜氏小管中有4/5的氣體，其他菌株的產(chǎn)氣能力相對較弱；當36 h時，除Y6-15和Y6-28之外，其他菌株都將杜氏小管中充滿氣體；在36，48 h時，所有菌株都將杜氏小管中充滿氣體。綜上所述，可以判斷7株誘變菌株的起酵能力為：Y6-8>Y6-33=Y6-31>Y6-15>Y6-10>Y6-28，因此初步確定Y6-8為目標菌株。

2.4 誘變菌株復篩

將7株菌株分別接種到葡萄汁后，其產(chǎn)酒精產(chǎn)酸情況如表4所示，與出發(fā)菌株相比，誘變菌株的產(chǎn)酸產(chǎn)酒精能力明顯增強，與初篩結果一致，說明ARTP處理能夠改變菌株的某些基因，從而改變菌株的功能。6株菌株產(chǎn)酒精能力依次為：Y6-8>Y6-31>Y6-15>Y6-33>Y6-10>Y6-28；6株突變菌株的產(chǎn)酸能力也存在一定的差別，其能力強弱依次為：Y6-8>Y6-15>Y6-31>Y6-33>Y6-28>Y6-10，但菌株產(chǎn)主要有機酸種類基本一致，為L-乳酸、酒石酸以及蘋果酸。由此可以猜測菌株經(jīng)過ARTP處理后，雖然產(chǎn)酸能力的強弱得到了改變，但產(chǎn)主要有機酸種類不會發(fā)生改變。GB 15037—2006 《葡萄酒》中限定葡萄

表3 6株誘變酵母菌株杜氏小管60 h間產(chǎn)氣情況?

? “+++++”表示杜氏小管中充滿氣體；“++++”表示杜氏小管中充滿4/5的氣體；“+++”表示杜氏小管中充滿1/2的氣體；“++”表示杜氏小管中充滿1/3的氣體；“+”表示杜氏小管中充滿1/5的氣體；“-”表示杜氏小管中無氣體。

表4 6株誘變酵母菌株與出發(fā)菌株產(chǎn)酒精產(chǎn)酸情況

酒中揮發(fā)酸≤1.2 g/L，以上菌株均符合要求，因此，最終將Y6-8確定為目標菌株。

2.5 遺傳穩(wěn)定性試驗

將突變菌株Y6-8培養(yǎng)5代，把每一代菌液接種到葡萄汁中發(fā)酵10 d，發(fā)酵液的酒精度和總酸分析結果見圖3。由圖3可知，第3代菌株產(chǎn)酒精能力最強為12.7%vol，第5代菌株產(chǎn)酸能力最強為2.26 g/L。雖然5代菌株的產(chǎn)酸和產(chǎn)酒精能力存在微小差距，產(chǎn)酸能力都維持在2.2 g/L左右且揮發(fā)酸含量在0.33 g/L左右，產(chǎn)酒精能力都維持在12%vol以上。由此可以表明，突變菌株Y6-8的高產(chǎn)酸和酒精性能可以穩(wěn)定的遺傳。

圖3 Y6-8連續(xù)5代產(chǎn)酒精和產(chǎn)酸情況

3 結論

本研究以葡萄表面篩選出的釀酒酵母菌株Y6為出發(fā)菌，通過單因素試驗確定ARTP處理時間的最佳時間。通過TTC培養(yǎng)基試驗、溴甲酚綠培養(yǎng)基試驗以及杜氏小管試驗對突變菌株進行初步篩選，最后再經(jīng)葡萄汁發(fā)酵試驗和遺傳穩(wěn)定性試驗確定目標菌株為Y6-8，該突變菌株的產(chǎn)酸能力和產(chǎn)酒精能力較出發(fā)菌株Y6分別提高了214.93%和28.13%，該菌株在一定程度上可以解決新疆葡萄酒糖高酸低的現(xiàn)狀，提高新疆葡萄酒品質(zhì)。同時說明ARTP誘變能夠高效率改變菌株的發(fā)酵性能。但該研究僅將誘變菌株Y6-8在紅葡萄酒發(fā)酵過程中給予驗證，在白葡萄酒的生產(chǎn)中還有待進一步驗證。