谷偉，黃天晴，徐革鋒，王炳謙

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

虹鱒Oncorhynchus mykiss的性別決定機(jī)制為XX/XY[1]，雌性虹鱒染色體為XX型，雄性為XY型。通過(guò)體外激素誘導(dǎo)全雌性虹鱒，可產(chǎn)生性反轉(zhuǎn)功能性雄魚(yú)，即染色體核型為XX，但可產(chǎn)生功能性精液的“偽雄魚(yú)”。偽雄魚(yú)與全雌性虹鱒雜交，通過(guò)靜水壓方法處理受精卵，阻止其第二極體排放，即可獲得全雌三倍體虹鱒[2]。因此，偽雄魚(yú)是大批量生產(chǎn)全雌三倍體虹鱒必不可少的條件。研究偽雄魚(yú)性別特異基因表達(dá)模式，與普通雌性和雄性虹鱒的表達(dá)模式進(jìn)行比較，對(duì)于全雌三倍體虹鱒制種技術(shù)具有重要的理論意義。

Sox9（SRY-related HMG box 9）基因是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)哺乳動(dòng)物精子發(fā)生以及維持精巢發(fā)育具有重要的作用[3]。硬骨魚(yú)的sox9基因在性腺發(fā)育過(guò)程中顯著表達(dá)，對(duì)生殖細(xì)胞與支持細(xì)胞的分化有重要的影響[4]。研究表明，sox9基因在雌雄虹鱒性腺中表達(dá)顯著不同[5]。Amh（anti-Mullerian hormone）為抗繆勒氏管激素，是魚(yú)類(lèi)性腺向雄性分化的重要影響因子[6]。Amh在比目魚(yú)和虹鱒精巢組織中的表達(dá)顯著高于卵巢組織[7,8]。在受精后30d的斑馬魚(yú)Barchydanio rerio var中，amh為驅(qū)使其性腺雄性化發(fā)育的關(guān)鍵基因[9]。在天然性逆轉(zhuǎn)雄性以及正常雄性的半滑舌鰨Cynoglossus semilaevis Gunther性腺中，amh基因的表達(dá)均顯著高于正常雌性[10]。因此，sox9與amh為典型的硬骨魚(yú)類(lèi)雄性特異基因。

本研究以正常雌、雄性以及激素處理的偽雄虹鱒為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)驗(yàn)證三者不同組織中雄性特異基因sox9和amh的表達(dá)情況，為挖掘sox9與amh基因的潛在功能和了解偽雄虹鱒的性腺發(fā)育提供依據(jù)，為虹鱒全雌三倍體制種技術(shù)研究奠定重要理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用雄性（XY）、雌性（XX）和偽雄（XX）虹鱒均為3齡魚(yú)，采集于中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所渤海冷水性魚(yú)類(lèi)試驗(yàn)站。通過(guò)人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育技術(shù)建立全雌虹鱒基礎(chǔ)群體，在此基礎(chǔ)上采用17-α甲基睪丸酮誘導(dǎo)批量制備性反轉(zhuǎn)功能性雄魚(yú)，即為“偽雄魚(yú)”。3齡雄性、雌性和偽雄虹鱒各選取5尾，麻醉后分別取性腺、背肌、腹肌、肝臟、后腸、中腸、前腸、腦、腦垂體、脾、腎臟、心臟以及幽門(mén)盲囊組織，將新鮮組織加入RNA保護(hù)液，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

總RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自博日公司，RNA later購(gòu)于Takara公司，用于保存組織樣本，防止RNA降解。熒光定量試劑盒購(gòu)于Roche公司。

1.2 總RNA提取

按照BioFlux Simply P總RNA提取試劑盒方法，先將雄、雌和偽雄虹鱒各組織在液氮中研磨。取不大于30mg組織粉末放入1.5mL離心管中，加入600 μL裂解液，室溫靜置 3～5min，取上清吸入純化柱，12 000r/min離心30s，之后加入洗滌液，洗滌兩遍，空離之后用50μL DEPC處理水洗脫，獲得總RNA。提取的各組織總RNA經(jīng)檢測(cè)，OD260/OD280比值均處于 1.8～2.1 之間，濃度均大于 1 μg/μL。

1.3 cDNA合成

cDNA合成按照BioRT高靈敏cDNA第一鏈合成試劑盒操作，反應(yīng)體系為 10 μL：Hybrid mix 5μL，Enzyme mix0.5μL，RNA2μg，補(bǔ)充 Nuclease-free水至 10 μL；反應(yīng)程序?yàn)椋?7℃ 20min，98℃ 5min。反應(yīng)結(jié)束后將cDNA放入-20℃保存，備用。實(shí)驗(yàn)全程戴一次性手套和口罩，防止污染，使用RNase-free移液槍頭和離心管。

1.4 Real-time PCR

利用Real-time PCR檢測(cè)雄、雌和偽雄虹鱒各組織中sox9和amh基因的表達(dá)。反應(yīng)體系為10μL：SYBR Mix5μL，上、下游引物各 0.2μL，cDNA0.5μL，dH2O 4.1μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃30s，95℃5s，60℃34s，40 個(gè)循環(huán)；95℃15s，60℃1min，95℃15s。用于熒光定量PCR檢測(cè)虹鱒sox9和amh基因的引物信息見(jiàn)表1。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果利用2-△△CT方法分析sox9和amh基因的相對(duì)表達(dá)量，基因相對(duì)表達(dá)量用（Mean±SD）表示，兩組數(shù)據(jù)間的差異比較利用One-way ANOVA方法，利用軟件SPSS 12.0來(lái)分析不同組之間的顯著性差異，P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著性差異。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物信息Tab.1 The primer sequences for Real-time PCR

2 結(jié)果與分析

由圖1可知，sox9基因在偽雄、雄性以及雌性虹鱒的13種組織中均有表達(dá)，但在性腺中表達(dá)量最高，腦組織次之，在脾、肝以及腦垂體中表達(dá)量也分別達(dá)到了顯著水平（P＜0.05）。Sox9基因在偽雄、雄性以及雌性虹鱒性腺組織中的表達(dá)量分別為背肌組織的 20.8、24.2以及 17.7倍（P＜0.01）。Sox9基因在這三種魚(yú)性腺中的表達(dá)量為：雄魚(yú)＞偽雄魚(yú)＞雌魚(yú)（P＜0.01）。而在腦組織中，該基因的表達(dá)量為：雌魚(yú)＞雄魚(yú)＞偽雄魚(yú)（P＜0.05）。在肝和脾組織中，sox9在偽雄魚(yú)中的表達(dá)量顯著高于普通雌、雄魚(yú)（P＜0.05）。Sox9基因在腦垂體中的表達(dá)量顯著高于其他組織（P＜0.05），而在這三種魚(yú)之間沒(méi)有顯著差異。

圖1 Sox9基因在偽雄、雄性和雌性虹鱒不同組織中的表達(dá)模式Fig.1 Expression profiles of sox9 gene in different tissues of pseudo-male,male and female rainbow trout

Amh基因的表達(dá)模式見(jiàn)圖2。該基因在偽雄、雄性以及雌性虹鱒性腺以及腦組織中的表達(dá)顯著高于其他組織（P＜0.01或 P＜0.05）。Amh基因在三種魚(yú)性腺中的表達(dá)分別為背肌的12.7、11.0以及5.4倍（P＜0.01）。Amh基因在偽雄魚(yú)性腺中的表達(dá)顯著高于雄、雌魚(yú)的性腺（P＜0.01）。Amh基因在偽雄魚(yú)腦組織中的表達(dá)顯著高于雄魚(yú)和雌魚(yú)（P＜0.05）。該基因在本研究的其他11種組織中的表達(dá)差異不顯著。

圖2 Amh基因在偽雄、雄性和雌性虹鱒不同組織中的表達(dá)模式Fig.2 Expression profiles of amh gene in different tissues of pseudo-male,male and female rainbow trout

3 討論

本研究利用實(shí)時(shí)定量PCR方法，檢測(cè)了偽雄魚(yú)和正常雌、雄虹鱒背肌、腹肌、肝臟、前腸、中腸、后腸、腦、脾臟、腎臟、心、腦垂體以及性腺中sox9和amh基因的表達(dá)模式，驗(yàn)證了激素誘導(dǎo)對(duì)關(guān)鍵性別特異基因表達(dá)的影響。利用雄激素處理得到的能產(chǎn)生正常精液的偽雄魚(yú)，在生產(chǎn)全雌虹鱒過(guò)程中起到重要作用，因此，開(kāi)展偽雄虹鱒性別特異基因的表達(dá)研究具有重要的理論意義。

Sox9基因在雌、雄和偽雄虹鱒的13種組織中的表達(dá)表明，該基因在性腺和腦中的表達(dá)顯著高于其它組織，這與黃顙魚(yú)和鱘魚(yú)中的結(jié)果一致[11,12]，表明sox9基因在許多組織中廣泛表達(dá)。研究表明：sox9基因負(fù)調(diào)控芳香化酶基因的表達(dá)[13]，而芳香化酶為雌激素合成過(guò)程中的限速酶[14]，因此，sox9基因的表達(dá)抑制了雌性激素的合成。本實(shí)驗(yàn)中，偽雄虹鱒性腺中sox9的表達(dá)顯著高于雌性卵巢中，表明甲基睪丸酮處理的虹鱒，促進(jìn)了性腺中sox9基因的表達(dá)，抑制了芳香化酶的表達(dá)，導(dǎo)致其性腺向雄性發(fā)育。雖然，虹鱒為XY型的性別決定[1]，但其性腺的發(fā)育可受到激素的影響[15]。本研究以雄激素處理的虹鱒偽雄魚(yú)為研究對(duì)象，驗(yàn)證了sox9基因高水平表達(dá)可能為其性腺雄性化的關(guān)鍵原因之一。然而，偽雄性腺中sox9基因的表達(dá)仍然顯著低于雄性精巢，推測(cè)基因型對(duì)性別決定的作用大于外源激素的誘導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)還表明，sox9基因在雌性腦組織中的表達(dá)顯著高于雄魚(yú)和偽雄魚(yú)，表明性腺細(xì)胞中分泌的雌激素會(huì)抑制腦組織中激素的分泌，從而導(dǎo)致sox9基因的表達(dá)升高。值得注意的是，sox9基因在肝臟和脾臟中呈顯著的高表達(dá)，偽雄魚(yú)這兩種組織中的表達(dá)顯著高于其他兩種性別，而肝臟和脾臟均為魚(yú)類(lèi)重要的免疫器官[16,17]，因此sox9基因是否具有免疫作用值得深入研究，同時(shí)，探索偽雄魚(yú)的非特異性免疫與特異性免疫能力也具有重要的作用。

Amh基因在雌、雄性與偽雄虹鱒的性腺和腦中呈現(xiàn)顯著的高表達(dá)，而在其他組織中的表達(dá)卻微乎其微，這與在羅非魚(yú)和半滑舌鰨中得到的結(jié)果相似[18,19]。Amh基因可抑制繆勒氏管的分化[20]，硬骨魚(yú)類(lèi)一般不存在繆勒氏管結(jié)構(gòu)，但其對(duì)硬骨魚(yú)類(lèi)精巢的發(fā)育起到重要的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，amh基因在偽雄魚(yú)性腺中的表達(dá)顯著高于雌性，甚至顯著高于雄性，暗示amh在虹鱒性反轉(zhuǎn)的過(guò)程中扮演重要的角色，促進(jìn)其向雄性發(fā)育。偽雄虹鱒受到雄性激素的處理，amh在腦組織中的表達(dá)也顯著高于雌性與雄性虹鱒?？梢酝茰y(cè)，雄激素的處理誘導(dǎo)了腦中amh基因表達(dá)的上調(diào)，抑制了其雌性激素的分泌，最終導(dǎo)致個(gè)體雄性化逆轉(zhuǎn)。

總之，偽雄虹鱒各組織中雄性特異基因sox9和amh的表達(dá)模式可為深入了解偽雄魚(yú)的性腺發(fā)育模式奠定理論基礎(chǔ)，對(duì)于實(shí)現(xiàn)全雌性虹鱒規(guī)模化制種技術(shù)提供了參考。