王樂，程磊，王秋實(shí)

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

黃顙魚Pelteobagrusfulvidraco廣泛分布在我國長江、珠江和黑龍江等各大淡水域，肉質(zhì)鮮美細(xì)嫩、無肌間刺，富含多種蛋白質(zhì)，是一種深受消費(fèi)者喜愛的淡水名優(yōu)養(yǎng)殖對象[1,2]。黃顙魚生長速度較為緩慢，即使是在相同的養(yǎng)殖環(huán)境中，雄性的生長速度也遠(yuǎn)快于雌性[3]。黃顙魚是研究性別分化及生長調(diào)控機(jī)理的典型魚類。

抗繆勒氏管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）也叫繆勒氏管抑制物（Müllerian inhibiting substance，MIS），是 β 轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族中的一員[4]。由法國科學(xué)家Jost在1940年首次發(fā)現(xiàn)后，Picard等于1984年首次從初生牛犢的胚胎精巢中提取純化獲得AMH的蛋白，之后相繼在各種哺乳動物中開展相關(guān)研究[5,6]。AMH是性別分化的重要調(diào)控因子，在哺乳動物的雄性性腺分化期可以抑制繆勒氏管形成，表明AMH可能對雄性個體的精巢發(fā)育有一定作用[7]；雌性個體的AMH可阻止原卵泡的形成，降低卵泡刺激素的分泌[8]，在卵巢生理中起重要調(diào)控作用[9]。早期AMH的研究主要集中在哺乳動物和鳥類中，大部分硬骨魚沒有繆勒氏管，對魚類研究的很少。直到2002年，Miura等在日本鰻鱺Anguilla japonica中發(fā)現(xiàn)了一個精子誘導(dǎo)激素的cDNA，雖然與已獲得的AMH同源性很低，但其作用模式卻與哺乳動物及鳥類的AMH極為相似，功能分析驗證為魚類的AMH[10]。其特殊的表達(dá)模式在硬骨魚性腺發(fā)育中也起重要的調(diào)控作用。本項目組測序獲得了黃顙魚的基因組數(shù)據(jù)，并在性別分化及生長調(diào)控機(jī)理的研究方面取得了一定進(jìn)展[11-13]。本試驗通過克隆黃顙魚AMH基因序列，分析該基因組織表達(dá)模式，以期為黃顙魚性別分化及生長調(diào)控機(jī)理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用1、2齡黃顙魚各30尾，購買自淡水魚批發(fā)市場。采用活體快速解剖的方式收集腦、鰓、腎、肝、脾、性腺、肌肉及血液組織，迅速放入液氮中保存，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中，用于提取總RNA。將尾鰭樣本保存在95%酒精溶液中，用于提取DNA。

1.2 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

采用TRNzol Universal試劑（天根生化公司）提取樣品總RNA。取保存于-80℃的組織樣品50mg和血液300μL，加入1mLTRNzol Universal試劑，置于冰上快速勻漿完全，利用氯仿-異丙醇提取法分離純化后溶解于RNase-Free ddH2O中，DNase I（TaKaRa）純化，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，以Nanodrop8000檢測RNA純度及濃度，RNase-Free ddH2O稀釋至 50ng/μL。

本試驗的反轉(zhuǎn)錄處理包括兩種：第一種反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA用于AMH基因開放閱讀序列的擴(kuò)增。該擴(kuò)增利用PrimeScriptTMRT-PCR Kit（TaKaRa），按說明書采用兩步法完成。第一步反應(yīng)采用10μL體系，總RNA的用量為1μg，反應(yīng)條件為65℃，5min；第二步反應(yīng)采用相應(yīng)的20μL體系，反應(yīng)條件為42℃處理20min，95℃處理5min，然后進(jìn)行70℃，15min的失活處理。保存于-20℃。

第二種反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于Real-Time PCR實(shí)驗，利用 PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）（TaKaRa）于冰上操作，按說明書指示完成，采用10μL體系，總RNA的用量為200ng。37℃反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)15min，85℃酶失活處理5s，-20℃保存。

1.3 DNA提取純化

剪取少量尾鰭，利用酚-氯仿抽提法純化總DNA。DNA溶解于RNase-Free ddH2O中，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。以Nanodrop 8000檢測DNA的純度和濃度后，用RNase-FreeddH2O稀釋到約50ng/μL備用。

1.4 AMH基因擴(kuò)增

全長序列的擴(kuò)增引物設(shè)計來源于NCBI中已發(fā)布的近緣物種斑點(diǎn)叉尾Ictalurus punctatus的AMH 序列（XM_017477698）（表 1）。擴(kuò)增反應(yīng)所用模板分別為總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄所得cDNA及提取純化的DNA。每個PCR反應(yīng)體系為50μL，包含25μL的 2×Es Taq MasterMix（Dye）（康維世紀(jì)）、10μM的上下游引物各2μL和1μL的模板，用ddH2O補(bǔ)足至50μL。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5min；擴(kuò)增35個循環(huán)，每個循環(huán)94℃變性30s、60℃退火60s、72℃延伸90s；72℃終延伸15min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后，用Axygen膠回收試劑盒純化。純化產(chǎn)物連接至pMD19-T載體（TaKaRa），并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞（TaKaRa）。挑選陽性單克隆經(jīng)PCR驗證后，送至金唯智生物公司測序。

表1 本研究所用的引物信息Tab.1 Primersusedinexperiment

1.5 AMH基因序列及結(jié)構(gòu)分析

使用軟件BioEdit 7.0將測序所獲得AMH序列信息進(jìn)行拼接整理；利用Expasy的在線工具Translate（https：//web.expasy.org/translate/）預(yù)測 AMH 基因的開放閱讀框及氨基酸序列；利用Expasy的在線工具 ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）計算預(yù)測該蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)和分子量信息；用在線工 具 SignalP 4.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測分析信號肽序列及半胱氨酸殘基；利用軟件Clustalx 1.81進(jìn)行黃顙魚AMH與其他物種AMH氨基酸間多序列比對；用cluster W軟件進(jìn)行多重比對黃顙魚AMH與其他物種AMH氨基酸間同源性；利用 SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/smart/）分析蛋白結(jié)構(gòu)和功能。應(yīng)用MEGA4.0軟件進(jìn)行1 000次bootstraps值驗證，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 AMH基因的表達(dá)分析

以 SYBR Premix ExTaqTM（TaKaRa）操作說明為指導(dǎo)，使用QuantStudio 6 Flex系統(tǒng)（Applied Biosystems）進(jìn)行Real-Time PCR反應(yīng)，檢測AMH基因在不同組織中的表達(dá)，Real-Time PCR的引物根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果，在開放閱讀框內(nèi)設(shè)計獲得。內(nèi)參基因為黃顙魚β-actin。引物合成由金唯智生物公司完成，信息如表1所示。反應(yīng)體系20μL，包括SYBR Premix Ex TaqTM（2×）10μL、正向引物及反向引物（10μm）各 0.4μL、ROX Reference DyeⅡ0.4mL和模板cDNA 1μL，用ddH2O補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件為標(biāo)準(zhǔn)的兩步法程序：95℃預(yù)變性10s；擴(kuò)增40個循環(huán)，每個循環(huán)95℃變性5s、60℃退火34s。反應(yīng)結(jié)束后，溶解曲線的反應(yīng)條件為：95℃持續(xù)15s，60℃持續(xù)1min，95℃持續(xù)15s。每個樣品重復(fù)3次取均值，應(yīng)用2-ΔΔCT法計算AMH基因的表達(dá)量[14]。用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和顯著性檢驗，P＜0.05時為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃顙魚AMH基因序列分析

以黃顙魚總RNA反轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板，經(jīng)克隆擴(kuò)增獲得AMH基因的開放閱讀框序列，而以黃顙魚DNA為模板，經(jīng)克隆擴(kuò)增獲得AMH的基因組序列。將兩測序結(jié)果比對分析，確定其外顯子及內(nèi)含子的組成及序列信息，獲得GenBank檢索號MK310106。

黃顙魚AMH全長3 588bp，其開放閱讀序列為1 653bp，由7段外顯子組成，可編碼550個氨基酸序列，非編碼序列包括959bp的5’-非編碼區(qū)序列（5’-UTR）、6段內(nèi)含子序列及 119bp的 3’-非編碼區(qū)序列（3’-UTR）組成（圖1A）。SMART分析表明，編碼的氨基酸序列包含20個信號肽序列及9個半胱氨酸殘基，含有 AMH-N區(qū)域（87～440）及TGF-β 結(jié)構(gòu)域（458～550）（圖 1B）。預(yù)測所得蛋白分子量為61.40 ku，理論pI為5.94，不穩(wěn)定系數(shù)為49.66，該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)為85.25，親水性系數(shù)為-0.331，表明其為親水性蛋白。

2.2 AMH基因同源性分析

用Cluster W軟件進(jìn)行的氨基酸序列同源性比較表明（圖2）：不同物種間的AMH氨基酸序列差異很大。本研究獲得的AMH基因序列與已發(fā)表的基因序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，其與黃顙魚Tachysurus fulvidraco的相似性最高，達(dá)99.6%，與低眼無齒Pangasianodon hypophthalmus及斑點(diǎn)叉尾的相似性也很高，分別達(dá)75.8%與74.8%，而與獅尾狒、黑猩猩等高等哺乳動物相似性最低。氨基酸序列的多重比對結(jié)果也進(jìn)一步驗證了這種同源性分析結(jié)論（圖3）。這表明AMH在不同物種中的保守性并不高。

圖1 黃顙魚AMH的DNA全長序列及氨基酸序列Fig.1 The full-length DNA and deduced amino acid sequences of AMH in yellow catfish

進(jìn)一步直觀研究AMH的進(jìn)化特征，利用Mega4.0軟件中的NJ法繪制AMH基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4），所有的AMH序列都來源于硬骨魚、哺乳動物等脊椎動物，GenBank檢索信息如下：黃顙魚（MK310106）、黃顙魚 Tachysurus fulvidraco（XP_027 007942）、低眼無齒（XP_026803092）、斑點(diǎn)叉尾（XP_017333187）、墨西哥脂鯉Astyanax mexicanus（XP_022525495）、納氏臀點(diǎn)脂鯉Pygocentrus natterer（iXP_017572294）、電鰻Electrophorus electricus（XP_026873942）、安水金線鲃 Sinocyclocheilus anshuiensis （XP_016327204）、 鯉Cyprinuscarpio（XP_018920046）、斑馬魚Danio rerio（XP_009294509）、犀角金線鲃 Sinocyclocheilus rhinocerous（XP_016395808）、滇池金錢鲃 Sinocyclocheilus grahami（XP_016138462）、四川裂腹魚Schizothorax kozlovi（ASU44862）、 北 極 紅 點(diǎn) 鮭Salvelinus alpinus（XP_023855208）、鯽 Carassius auratus（AHL68989）、核雅羅魚 Squalius pyrenaicus（ABX55992）、黑鯽 Carassius gibelio（AKP99417）、虹鱒 Oncorhynchus mykiss（XP_021459508）、浪白魚Anabarilius graham（iROL40795）、大鱗大麻哈魚Oncorhynchus tshawytscha（XP_024277327）、大西洋鮭Salmo salar（ADJ38820）、Seriolalalandi dorsalis（XP_023263819）、人 Homo sapiens（EAW69397）、黑猩猩 Pan troglodytes（XP_016790129）、獅尾狒Theropithecus gelada（XP_025222375）。分析結(jié)果如圖4所示，除一種Seriola lalandi dorsalis進(jìn)化地位比較特殊外，所有的AMH均可為兩個大分支：哺乳動物為一支，其他魚類為另一支。黃顙魚AMH先與斑點(diǎn)叉尾、低眼無齒等鯰形目物種聚集成簇，再與電鰻、納氏臀點(diǎn)脂鯉等聚類。

圖2 黃顙魚AMH同其他脊椎動物AMH氨基酸同源性比較Fig.2 Comparative homology of the amino acid sequences of yellow catfish AMH with other vertebrate AMH

2.3 黃顙魚AMH基因的mRNA表達(dá)

Real-Time PCR檢測AMH基因在不同生長階段黃顙魚的腦、鰓、腎、肝、脾、性腺、肌肉及血液中的表達(dá)情況（圖5）。結(jié)果表明，AMH基因的mRNA在不同組織中的表達(dá)水平差異很大。1齡雄魚各組織的表達(dá)量顯著高于1齡雌魚，尤其是性腺、肝、腎中，雄性表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于雌性，只有在脾中，雄性表達(dá)量略低于雌性；2齡魚中，AMH基因的表達(dá)量僅雄性的性腺、脾中顯著高于雌性，而在雄性腦和血液中表達(dá)量又明顯低于雌性，在其他的組織中的表達(dá)基本相似。

3 討論

Miura等（2002）在日本鰻鱺中發(fā)現(xiàn)了第一個魚類的AMH基因，隨后在大西洋鮭Salmo salar、日本青鰈 Paralichthys olivaceus、斑馬魚 Danio rerio、青Oryzias latipes、奧利亞羅非魚Oreochromis aurea等魚類中相繼開展了AMH的克隆研究工作[10]。

本研究首次擴(kuò)增獲得了黃顙魚的AMH基因，全長3 588bp，其開放閱讀序列為1 653bp，可編碼550個氨基酸序列。測序結(jié)果經(jīng)比對分析，與本項目組前期測序獲得的黃顙魚基因組上部分信息完全一致。BLAST分析將本研究擴(kuò)增獲得的AMH基因定位于基因組序列2號染色體chr2的19371164～19374761區(qū)間。SMART分析表明，黃顙魚AMH基因編碼蛋白含有典型的AMH-N區(qū)域及TGF-β結(jié)構(gòu)域。AMH-N結(jié)構(gòu)域上的糖基化位點(diǎn)及TGF-β結(jié)構(gòu)域上含有的特異性裂解位點(diǎn)，可有助于AMH形成蛋白二聚體，同時含有9個保守的半胖氨酸殘基，這與之前的研究結(jié)論相一致，經(jīng)驗證該蛋白屬于TGF-β超家族[15]。

圖3 預(yù)測的黃顙魚AMH氨基酸序列及與其他魚類AMH氨基酸序列的比較。Fig.3 Predicted amino acid sequence of yellow catfish AMH and alignment with other teleost

起初關(guān)于AMH表達(dá)的研究主要集中在性腺組本研究初步對黃顙魚的AMH進(jìn)行了克隆分離與鑒定析，但其對性別分化及發(fā)育的調(diào)控作用還有待進(jìn)一步研究?？棧@是因為AMH在性別分化及發(fā)育中起重要的調(diào)控作用。后來的研究表明，AMH在斑馬魚的腦、肌肉、眼、皮膚、腎、肝和心等組織中都有表達(dá)[16]。本研究中黃顙魚AMH的mRNA在腦、肌肉、肝等所檢測的組織中均有表達(dá)且存在著極大的差異性。這與Rodríguez-Marí等（2005）對斑馬魚中 AMH 的表達(dá)結(jié)果相類似[17]。1齡雄魚性腺中的表達(dá)量顯著高于2齡雄魚，這是因為黃顙魚精巢分化大致始于孵出后55d。在性腺分化時期，與性別分化相關(guān)的基因處于較活躍狀態(tài)，促進(jìn)了AMH的表達(dá)。而在性成熟時期，精母細(xì)胞和雄性激素的協(xié)同作用又有效抑制了AMH表達(dá)[18]。該檢測結(jié)果表明：AMH極可能在黃顙魚的性別分化及生長發(fā)育過程中都發(fā)揮重要作用。

圖4 NJ法構(gòu)建黃顙魚AMH與其他脊椎動物AMH系統(tǒng)樹Fig.4 Phylogenetic tree of yellow catfish AMH and other species AMH based on the Neighbor-joining method

圖5 AMH基因mRNA在黃顙魚各組織中的表達(dá)水平Fig.5 mRNA expression level of AMH gene in different tissues of yellow catfish