張秀玲胡 冉孫 穎高凱悅孫淑芳王雨璐厲 潔

(1. 德州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,山東 德州 253023;2. 山東省高校生物技術(shù)與生物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 德州 253023)

酸雨是指pH值小于5.6的雨、雪、霧、雹等大氣降水[1]。當(dāng)前,酸雨問(wèn)題已成為當(dāng)今世界面臨的重大生態(tài)問(wèn)題[2]。中國(guó)現(xiàn)已成為繼歐洲和北美之后的世界第三大酸雨區(qū),其面積已達(dá)國(guó)土面積的40%[3]。酸雨能使土壤酸化、鹽基離子流失,導(dǎo)致作物根系發(fā)育受阻、活力下降,并影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收與利用[4]。當(dāng)酸雨酸度達(dá)到一定閾值時(shí),會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生嚴(yán)重不利影響,表現(xiàn)為植物膜系統(tǒng)損傷[5],呼吸速率加快,降低蒸騰速率、酶活性、葉綠素含量和光合效率等,導(dǎo)致作物減產(chǎn)[6]。

鈣可以維持細(xì)胞膜以及膜結(jié)合蛋白的穩(wěn)定性,在多種酶活性中起重要作用,是一種良好的膜保護(hù)劑。外源Ca2+能提高水稻、小麥葉片葉綠素含量[7-8],提高抗氧化酶活性,緩解鹽分、重金屬、酸雨等各種脅迫造成的傷害[9-10]。

花生(ArachishypogaeaL.)是我國(guó)重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物[11],山東是我國(guó)花生主產(chǎn)區(qū)之一,本文以花生幼苗為試材,研究外源鈣對(duì)硫酸型酸雨脅迫下花生幼苗抗氧化酶活性以及膜脂過(guò)氧化的影響,探討鈣對(duì)植物逆境傷害的緩解機(jī)理,以期為植物代謝的化學(xué)調(diào)控,強(qiáng)化植物抵抗酸雨脅迫的能力提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試花生品種為魯花12號(hào),由德州市種子公司提供。挑選均勻飽滿的花生種子,用0.01%的高錳酸鉀溶液消毒10 min,無(wú)菌水反復(fù)清洗干凈后吸脹24 h,置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中(直徑為15 cm),在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)箱參數(shù)設(shè)置晝夜溫度25/15,光照強(qiáng)度5700lx,光照周期14h/d,每日補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水分。待種子萌發(fā)出真葉后,將長(zhǎng)勢(shì)一致的花生幼苗種植于上口直徑26 cm、高28 cm的塑料盆中,每盆兩株幼苗,蛭石和營(yíng)養(yǎng)土混合比例為1∶1作為栽培土,于溫室中自然生長(zhǎng),晝夜溫度 28/22℃,相對(duì)濕度 85%,每2d澆灌一次1/4的hoagland營(yíng)養(yǎng)液(不含Ca2+) 150mL。待幼苗長(zhǎng)出4～5片真葉后,選取長(zhǎng)勢(shì)一致幼苗用作試驗(yàn)處理。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)山東省實(shí)測(cè)酸雨污染物成分[12],參照王艾平方法[7]以SO42-和NO3-質(zhì)量濃度比為5∶1的比例配制模擬酸雨母液,使用精密酸度計(jì)將母液以蒸餾水稀釋為pH值4.5的酸雨液。CaCl2濃度分別設(shè)為0、10、20、30、40和50mmol/L,對(duì)照無(wú)酸雨脅迫且無(wú)氯化鈣處理,共7個(gè)處理,3次重復(fù),隨機(jī)排列。

用小型噴霧器將不同濃度CaCl2溶液依次均勻噴灑在花生幼苗全株,每日于9:00,21:00各噴施1次,處理4d,用量25 mL/盆·次。生長(zhǎng)5d后以酸雨脅迫,24h一次,連續(xù)2次,方法、用量同前,酸雨脅迫6d后,采取同一部位的展開葉片,用于測(cè)定各項(xiàng)生理指標(biāo)。

1.3 測(cè)定方法

過(guò)氧化物酶(POD)含量的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[13],過(guò)氧化氫酶(CAT)的測(cè)定按武賢莉等[14]的方法進(jìn)行,超氧化物歧化酶(SOD)的測(cè)定參考王學(xué)奎[15]的方法。相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定采用浸泡法[16],丙二醛(MDA)和可溶性糖的測(cè)定采用硫代巴比妥酸顯色法[17]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS和 Excel軟件處理。用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和作圖,用 SPSS 19.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,差異顯著性分析采用LSD 法。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源鈣對(duì)酸雨脅迫下葉片SOD活性的影響

圖1可知,與正常對(duì)照相比,酸雨對(duì)照SOD活性提高了30.4%,表明沒有外源鈣的情況下,花生幼苗啟動(dòng)自身的防御機(jī)制,增加了SOD活性。隨CaCl2濃度增加,酸雨脅迫下SOD活性呈上升趨勢(shì),各CaCl2濃度下,分別比酸雨對(duì)照提高129%、151%、254%、272%、211%,與正常對(duì)照和酸雨對(duì)照差異顯著。表明外源鈣能有效提高SOD酶的活性,有效清除活性氧,降低植物細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基對(duì)植物的傷害。

圖1 不同濃度Ca2+對(duì)酸雨脅迫下SOD活性的影響Fig.1 Effect of Ca2+ concentration on SOD activity in peanut seedlings under acid rain stress

2.2 外源鈣對(duì)酸雨脅迫下葉片POD活性的影響

圖2可知,與正常對(duì)照相比,酸雨對(duì)照POD活性提高了11.4%,表明酸雨脅迫下產(chǎn)生了大量的O2-,誘導(dǎo)了POD活性上升,來(lái)清除逆境中花生幼苗體內(nèi)過(guò)多的O2-。隨外源鈣濃度升高,花生幼苗POD活性整體呈上升趨勢(shì),40 mmol/L的CaCl2處理下,較酸雨對(duì)照處理提高了85.6%,且差異顯著,表明在該濃度下外源鈣提高了酸雨脅迫下花生幼苗POD活性。50 mmol/L的CaCl2溶液處理下,酶活性迅速下降,外源鈣濃度過(guò)高抑制了POD活性。

圖2 不同濃度Ca2+對(duì)酸雨脅迫下POD活性的影響Fig.2 Effect of Ca2+ concentration on POD activity in peanut seedlings under acid rain stress

2.3 外源鈣對(duì)酸雨脅迫下葉片CAT活性的影響

由圖3看出,相比正常對(duì)照,酸雨脅迫使花生幼苗CAT活性提高了7.6%。隨外源鈣濃度升高,CAT活性呈先升后降趨勢(shì),10～50 mmol/L CaCl2均能提高花生幼苗的CAT活性,CaCl2濃度為30 mmol/L下,花生幼苗體內(nèi)CAT活性達(dá)到最大值,較酸雨對(duì)照增加了39.9%,與酸雨對(duì)照差異顯著。在40、50mmol/L的CaCl2處理濃度下,CAT活性呈下降趨勢(shì),但依然高于對(duì)照處理,與對(duì)照差異不顯著。表明外源鈣提高了酸雨脅迫下花生幼苗的CAT活性,提高了花生幼苗抵抗酸雨能力。

圖3 不同濃度Ca2+對(duì)酸雨脅迫下CAT活性的影響Fig.3 Effect of Ca2+ concentration on CAT activity in peanut seedlings under acid rain stress

2.4 外源鈣對(duì)酸雨脅迫下葉片MDA含量的影響

圖4可見,和正常對(duì)照相比,酸雨對(duì)照顯著增加了花生幼苗MDA含量,較對(duì)照增加了123.6%。隨CaCl2濃度增加,MDA含量呈下降趨勢(shì),10、20、30、40、50 mmol/L各CaCl2濃度下,比酸雨對(duì)照分別下 降 了7.6%、21.5%、29.2%、41%、3.3%,40 mmol/L CaCl2下,與正常對(duì)照差異不顯著。外源鈣降低了酸雨脅迫下花生葉片MDA含量,阻止膜質(zhì)過(guò)氧化。50 mmol/L CaCl2濃度下,MDA含量又上升,活性氧產(chǎn)生速度超過(guò)了清除能力,對(duì)幼苗產(chǎn)生了傷害,致使膜質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物增加。

圖4 不同濃度Ca2+對(duì)酸雨脅迫下MDA含量的影響Fig.4 EffectofconcentrationofCa2+ onMDAcontent in peanut seedlings under acid rain stress

2.5 外源鈣對(duì)酸雨脅迫下花生幼苗電導(dǎo)率的影響

植物受到脅迫時(shí),質(zhì)膜遭到破壞,膜透性增大,電導(dǎo)率上升。圖5表明,花生幼苗在酸雨對(duì)照下,相對(duì)電導(dǎo)率比空白對(duì)照增大了42.8%,表明酸雨脅迫造成膜系統(tǒng)損害。在10、20、30、40mmol/L的CaCl2濃度處理下,相對(duì)電導(dǎo)率呈下降趨勢(shì),分別比酸雨對(duì)照下降了49.7%、50.2%、50.3%和38.9%,且均低于空白對(duì)照且差異顯著,表明外源鈣能有效緩解酸雨對(duì)花生幼苗細(xì)胞膜的損傷。50 mmol/L的CaCl2濃度處理下,相對(duì)電導(dǎo)率顯著上升,本濃度下SOD、CAT活性下降,清除活性氧能力減弱,引起膜質(zhì)過(guò)氧化,導(dǎo)致膜透性增高。

圖5 不同濃度Ca2+對(duì)酸雨脅迫下花生幼苗電導(dǎo)率的影響Fig.5 Effect of concentration of Ca2+ on relative conductivity in peanut seedlings under acid rain stress

2.6 外源鈣對(duì)酸雨脅迫下花生幼苗可溶性糖含量的影響

圖6可知,與正常對(duì)照相比,酸雨對(duì)照花生幼苗體內(nèi)可溶性糖的含量顯著降低。花生幼苗可溶性糖在CaCl2濃度0～50 mmol/L范圍內(nèi),可溶性糖含量呈先上升后下降的趨勢(shì),但各濃度處理下均高于酸雨對(duì)照,差異不顯著,且均低于正常對(duì)照并差異顯著。可溶性糖是調(diào)節(jié)滲透脅迫的小分子物質(zhì),也是合成其他有機(jī)溶質(zhì)的碳架和能量來(lái)源[18]。酸雨脅迫下,會(huì)產(chǎn)生許多酸雨脅迫誘導(dǎo)蛋白,蛋白的合成會(huì)消耗糖的含量,所以糖的含量會(huì)降低。隨CaCl2濃度增高,可溶性糖含量有下降趨勢(shì)。

圖6 不同濃度Ca2+對(duì)酸雨脅迫下花生幼苗可溶性糖含量影響Fig.6 Effect of concentration of Ca2+ on soluble sugar in peanut seedlings under acid rain stress

3 討論與結(jié)論

逆境脅迫下植物產(chǎn)生自由基引起膜脂過(guò)氧化。SOD、CAT、POD是細(xì)胞內(nèi)3種重要的保護(hù)酶,SOD 能清除O2-、·OH而形成 H2O2,POD和CAT則催化H2O2為H2O[19],從而能有效阻止O2-和H2O2的積累及抑制-OH 的產(chǎn)生,對(duì)膜系統(tǒng)起保護(hù)作用[20-21]。當(dāng)植物受到酸雨脅迫時(shí),活性氧代謝紊亂,清除活性能力降低,質(zhì)膜結(jié)構(gòu)遭到破壞,導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化[24-25]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,30mmol/L Ca2+處理有效地誘導(dǎo)了CAT活性的增強(qiáng)。40 mmol /L Ca2+處理POD、SOD活性達(dá)到最大值。表明Ca2+處理有效清除了逆境脅迫下積累的部分自由基,緩解了酸雨對(duì)花生幼苗的脅迫傷害。酸雨脅迫使花生幼苗MDA含量增加,40 mmol/L Ca2+處理明顯降低了MDA含量,降低膜脂過(guò)氧化作用,減輕膜脂過(guò)氧化對(duì)植物細(xì)胞的傷害。

當(dāng)植物受到逆境傷害時(shí),容易出現(xiàn)細(xì)胞膜破裂,膜蛋白受損,電解質(zhì)溶液外滲,從而導(dǎo)致相對(duì)電導(dǎo)率增大[26]。在外源鈣處理下,相對(duì)電導(dǎo)率呈下降趨勢(shì)。Ca2+可作為生物膜的穩(wěn)定劑,在維持植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與完整性方面起重要的作用[27]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,鈣對(duì)酸雨脅迫下,花生幼苗細(xì)胞膜透性變化和MDA含量的變化趨勢(shì)相似,Ca2+處理抑制了細(xì)胞電解質(zhì)的滲漏。本研究結(jié)果顯示,30 mmol/L Ca2+可穩(wěn)定花生幼苗葉片的質(zhì)膜結(jié)構(gòu),降低質(zhì)膜透性,表現(xiàn)出對(duì)酸雨脅迫的良好防護(hù)作用。研究結(jié)果表明,酸雨脅迫下可溶性糖含量顯著降低,可能是由于酸雨脅迫誘導(dǎo)了蛋白產(chǎn)生消耗了光合作用的產(chǎn)物。隨著外源鈣的加入,可溶性糖含量有所上升,說(shuō)明鈣緩解了酸雨脅迫對(duì)花生幼苗的傷害。但可溶性糖能否作為抗性鑒定指標(biāo)還有待于進(jìn)一步研究。