孔偉偉田麗彬李榮沖肖麗娜崔 鳳劉譯陽李國衛(wèi)*萬書波*

(1.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東 濟(jì)南 250014; 2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心,山東 濟(jì)南 250100)

花生在我國種植廣泛,是重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物,出油率高達(dá)45%～50%,與其他油料作物相比優(yōu)勢明顯[1]。花生屬于豆科植物,除了通過根系吸收土壤中的氮素,根瘤菌固氮也是氮素利用的一種重要方式。氮元素是構(gòu)成生物的主要元素之一,在植物體內(nèi)參與蛋白質(zhì)、核酸、葉綠素等生物大分子的合成,影響植物的生長和果實的發(fā)育,對作物產(chǎn)量和品質(zhì)的影響較大[2]。銨態(tài)氮(NH4+-N)和硝態(tài)氮(NO3--N)是作物吸收利用的主要氮素形態(tài),其中硝態(tài)氮是旱地作物吸收利用的主要氮源。硝態(tài)氮的吸收主要由低親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NRT1)和高親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NRT2)完成[3]。因此,研究硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能及其在植物氮素吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用非常必要。

硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(NRT1)家族是植物中最大的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族[4]。迄今為止,在擬南芥中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了11個低親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,分別為AtNRT1.1～AtNRT1.9,AtNRT1.11和AtNRT1.12[5],其中AtNRT1.1是第一個被發(fā)現(xiàn)和定位的低親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[6]。因此,利用生物信息學(xué)綜合分析NRT1基因家族特征,并研究其對鹽脅迫的響應(yīng),可以為深入研究花生NRT1基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物培養(yǎng)及鹽處理

供試花生品種為Tifrunner,種子置于沙土中萌發(fā)7～8 d,待下胚軸將子葉完全頂出沙土且長出真葉時,將幼苗移出,用自來水將根部沙子沖洗干凈,移到盛有2L Hoagland培養(yǎng)液的水培盒中進(jìn)行水培,每盒4株幼苗。在18 d苗齡時選生長基本一致的植株進(jìn)行梯度鹽脅迫處理。

鹽處理濃度梯度分別為:0、100、150、200、250和300 mmol/L NaCl。每個濃度處理設(shè)3次重復(fù),鹽脅迫處理時間為4 d。

1.2 葉片硝酸鹽含量的測定

花生幼苗鹽脅迫處理4 d后,將完整植株從水培盒中取出,用蒸餾水將表面沖洗干凈,吸水紙吸干表面的水分,取整株的葉片,用錫箔紙包好,置于80℃烘干至恒質(zhì)量。還原法測定硝酸鹽含量[7]。

1.3 基因檢索

在TAIR網(wǎng)站(https://www.arabidopsis.org/)中檢索獲得擬南芥NRT1的蛋白序列,并用擬南芥NRT1的蛋白序列在花生基因組數(shù)據(jù)庫Peanutbase(https://peanutbase.org/)中運(yùn)行Blastp程序,以滿足E-value＜e-100的標(biāo)準(zhǔn)篩選出Pfam00854的目標(biāo)蛋白序列,以FASTA格式進(jìn)行保存。

1.4 生物信息學(xué)分析

將花生NRT1與擬南芥NRT1蛋白序列比對分析,利用Mega5.2軟件進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建。利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)軟件分析跨膜結(jié)構(gòu)域。利用花生轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(NCBI: PRJNA354652),查找NRT1基因家族,并使用Cuffdiff軟件計算花生22個不同組織的表達(dá)量(FPKM值)[8],利用HemI軟件進(jìn)行表達(dá)模式分析。利用GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)在線軟件分析基因結(jié)構(gòu)。

1.5 基因表達(dá)分析

RNA提取、文庫構(gòu)建、高通量測序及差異基因分析參照Cui等[9]方法。將培養(yǎng)18 d的花生幼苗用250 mmol/L NaCl脅迫處理 4 d后,將根和葉片分別取樣,利用RNAiso Reagent試劑盒提取RNA,利用DNase I去除基因組DNA污染。RNA質(zhì)量檢測、建庫,利用華大基因(BGI)的Illumina HiSeq 2000 平臺進(jìn)行測序,每組樣品設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。用NOISeq法篩選3個生物樣品間的差異表達(dá)基因,標(biāo)準(zhǔn)為:|log2ratio|≥1,p值≥0.8。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對花生葉片硝酸鹽積累的影響

圖1 不同濃度鹽脅迫條件下花生葉片硝酸鹽含量Fig.1 Nitrate content in peanut leaf under various salt stress

花生屬中等耐鹽植物,鹽脅迫明顯抑制花生的生長發(fā)育,鹽脅迫濃度越高越明顯。當(dāng)培養(yǎng)液中鹽脅迫濃度大于200 mmol/L時植株出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象。硝酸鹽含量測定結(jié)果顯示,葉片硝酸鹽含量隨鹽濃度升高逐漸降低。在100～300 mmol/L處理濃度下,葉片內(nèi)硝酸鹽含量分別比對照降低了31.4%、48.9%、74.8%、79.1%和81.8%(圖1)。

2.2 花生NRT1基因鑒定與系統(tǒng)進(jìn)化分析

在花生數(shù)據(jù)庫進(jìn)行NRT1基因檢索,共發(fā)現(xiàn)37個同源基因(表1)。這些基因不均勻地分布在A和B基因組中,分布在除B04和B08外的18條染色體的不同位置上。其中A基因組中有18個基因,A01上有4個,A03上有3個,A02、A05和A07上各有2個,A04、A06、A08、A09和A10上各有1個;B基因組中有19個基因,B01上有4個,B02、B03和B07上各有3個,B05和B06上各有2個,B09和B10上各有1個。這些基因被重命名為AhNRT1.1～AhNRT1.37。

表1 花生NRT1基因家族生物信息學(xué)分析Table 1 Bioinformatics analysis of NRT1 family in peanut

圖2 花生NRT1家族進(jìn)化樹Fig.2 The phylogenetic analysis of the NRT1 family in peanut

對這些蛋白的跨膜區(qū)分析發(fā)現(xiàn),37個花生NRT1蛋白都含多個跨膜區(qū),一條蛋白序列上跨膜區(qū)數(shù)目最多21個,最少8個。其中含10～12個跨膜區(qū)的蛋白數(shù)目最多 (表1)。

為揭示花生NRT1家族37個成員的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系,并對其進(jìn)行分類,利用11個擬南芥NRT1家族成員的蛋白全長序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)?；跀M南芥NRT1家族的分類情況,花生NRT1家族的37個成員形成A～F6個亞家族。A和D亞家族中分別只有2個和12個花生NRT1,而沒有擬南芥NRT1。B亞家族中僅有1個花生NRT1家族成員AhNRT1.30;C亞家族中10個花生NRT1家族成員與擬南芥AtNRT1.5和AtNRT1.8親緣較近,并且分支較多,說明該分支進(jìn)化較快,在進(jìn)化中產(chǎn)生較多變異;E和F亞家族中各有6個花生NRT1。同源性高的基因在功能上具有更高的相似性,花生與擬南芥中相近的NRT1蛋白可能具有相同或相似的功能。

2.3 花生NRT1基因結(jié)構(gòu)分析

37個花生NRT1基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),他們具有明顯不同特點(diǎn)(圖3)。AhNRT1.7、AhNRT1.9、AhNRT1.21、AhNRT1.26和AhNRT1.28含有6個以上外顯子,且堿基數(shù)目也較多,說明這5個基因可能發(fā)生外顯子增多的變異,從而導(dǎo)致基因長度也隨之增長。7個基因具有5個外顯子,22個基因具有4個外顯子,AhNRT1.1、AhNRT1.3和AhNRT1.20只有2～3個外顯子。

圖3 花生NRT1家族基因結(jié)構(gòu)Fig.3 Gene structure of NRT1s in peanut

圖4 花生NRT1基因組織特異性表達(dá)分析Fig.4 Tissue-specific expression of NRT1 family in peanut

2.4 花生NRT1基因組織表達(dá)分析

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),花生中37個NRT1基因在22個不同組織的表達(dá)量具有明顯的組織特異性(圖4)。AhNRT1.9和AhNRT1.28兩個基因在花生22個組織均有表達(dá),推測這兩個基因可能參與不同組織氮素的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn);AhNRT1.12在花生根瘤中表達(dá)量較高,表明其可能參與根瘤中氮素的吸收轉(zhuǎn)運(yùn);另外還有部分基因分別在花生的莖、葉、花、果莢以及種子處有較高表達(dá)。說明花生NRT1的表達(dá)具有時間和空間特異性,并可能在花生不同發(fā)育時期和不同組織中參與氮素吸收轉(zhuǎn)運(yùn)。

2.5 花生NRT1家族基因?qū)}脅迫的響應(yīng)

鹽脅迫處理后花生葉片中硝酸鹽的積累顯著降低,可能與硝酸鹽吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降有關(guān)。通過對表達(dá)譜數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn),在栽培花生品種Tifrunner中發(fā)現(xiàn)9個對鹽脅迫響應(yīng)的NRT1基因,根和葉片中分別有8個和6個NRT1基因表達(dá)受鹽脅迫調(diào)控。其中,根中AhNRT1.3和AhNRT1.10分別上升10.57倍和11.59倍;AhNRT1.10在葉片中上調(diào)最明顯,表達(dá)上升高達(dá)674.9倍。AhNRT1.18在根和葉片中的表達(dá)均受鹽脅迫抑制,而AhNRT1.10、AhNRT1.24和AhNRT1.30在根和葉片中的表達(dá)均受鹽脅迫誘導(dǎo) (圖5)。

圖5 花生NRT1鹽處理后相對表達(dá)量Fig.5 The relative expression of peanut NRT1s after salt stress

3 討 論

硝酸鹽是高等植物的主要氮源[10],大部分植物從土壤獲得的硝酸鹽通過硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NRT)進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)[11]。NRT1是植物中硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族,其功能研究一直備受關(guān)注。擬南芥等植物中NRT1家族研究已經(jīng)較明確,而花生中NRT1研究相對較少。本研究對花生NRT1基因家族進(jìn)行進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),37個花生NRT1按親緣關(guān)系遠(yuǎn)近分成6類?；蚪Y(jié)構(gòu)和跨膜區(qū)分析表明,6個亞族具有不同的跨膜區(qū)和外顯子數(shù)目,說明不同分支間DNA和蛋白序列差異比較大。

NRT1家族成員較大決定了其功能的多樣性及調(diào)控的復(fù)雜性。表達(dá)模式分析表明花生NRT1在花生22個組織中的表達(dá)具有明顯的組織特異性。B和C亞族基因與擬南芥中的AtNRT1.5,AtNRT1.8和AtNRT1.9親緣關(guān)系更近(圖2),說明花生中這些可能共同參與將根部吸收的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)到地上部[12]。大豆中的NRT1.2在根及根瘤中表達(dá)量較高,推測其參與根瘤菌共生固氮過程中氮素的轉(zhuǎn)運(yùn)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)AhNRT1.12在花生根瘤表達(dá)量最高,可能是參與根瘤固氮和氮素吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的主要蛋白。正常條件下花生NRT1基因在花生莖、葉、花、果莢以及種子處的表達(dá)量不同,這可能與不同組織中硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)的時空特異性有關(guān)。

NRT1可能參與逆境脅迫條件下植物硝酸鹽吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控。鹽脅迫條件下,花生中AhNRT1.3,AhNRT1.9,AhNRT1.11和AhNRT1.18等基因表達(dá)在根或葉片中下調(diào)可能是葉片中硝酸鹽積累下降的原因,同時硝酸鹽積累的下降也可能是植物生長受抑制的原因之一。而AhNRT1.3,AhNRT1.8,AhNRT1.10,AhNRT1.20,AhNRT1.24和AhNRT1.30等基因在鹽脅迫條件下表達(dá)增加可能有利于維持根或葉片中硝酸鹽的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。研究發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)型油菜NRT1.5和NRT1.8受低氮及重金屬鎘脅迫的誘導(dǎo)[14],說明NRT1也可能參與植物適應(yīng)其他類型逆境脅迫的調(diào)控。