孫靜靜，李桂林，周雷鳴，周偉偉，趙巧輝

目前全球越來越多的重組抗原及重組抗體用于醫(yī)療，尤其針對(duì)腫瘤、自身免疫病等難治病癥，以及體外診斷試劑。越來越多的高校和企業(yè)開始重視重組蛋白新藥的開發(fā)，這就要求能夠快速生產(chǎn)足夠候選蛋白用于臨床前研究，因此能夠快速生產(chǎn)毫克到克級(jí)別的重組蛋白瞬時(shí)表達(dá)體系開始得到廣泛應(yīng)用[1]。

重組蛋白的生產(chǎn)方法主要可分為兩種，一種是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（stable gene expression，SGE），另一種是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染（transient gene expression，TGE）。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，是指外源 DNA 轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞后將外源目的基因整合到宿主染色體中進(jìn)行表達(dá)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染需要使用線性 DNA，線性 DNA 雖然較超螺旋 DNA 轉(zhuǎn)入量低，但整合率高。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過程中，外源 DNA 整合到宿主細(xì)胞染色體中概率很小，只有大約 1%，且通常需要通過一些選擇性標(biāo)記反復(fù)篩選，才能得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，是指外源 DNA/RNA 轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞后不整合到宿主染色體中進(jìn)行外源目的基因的表達(dá)。因此一個(gè)宿主細(xì)胞中可存在多個(gè)拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動(dòng)子和其他調(diào)控元件的分析。一般來說，超螺旋質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)染效率較高。在轉(zhuǎn)染后 24～72 h（依賴于不同的構(gòu)建）分析結(jié)果時(shí)，常常用到一些報(bào)告系統(tǒng)如熒光蛋白、β 半乳糖苷酶等來幫助檢測。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于重組蛋白生產(chǎn)，不同的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)用于多種重組蛋白的制備。

規(guī)模化的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)工藝從前期質(zhì)粒 DNA 的制備、細(xì)胞的擴(kuò)增到瞬時(shí)基因轉(zhuǎn)染，所需時(shí)間不到一個(gè)月，即可獲得毫克到克級(jí)的蛋白產(chǎn)物，而且瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)的應(yīng)用規(guī)模越來越大，最大已達(dá)到百升的水平[2]。與穩(wěn)定基因表達(dá)相比，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染有三方面優(yōu)勢：第一，大大縮短了獲得重組蛋白的時(shí)間[3]；第二，技術(shù)門檻較低，幾乎可以在每一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室展開，無需特殊設(shè)備；第三，通量高，靈活性高，可以運(yùn)用到多種不同重組蛋白的表達(dá)，甚至包括對(duì)宿主細(xì)胞有毒性的蛋白，而且可同時(shí)進(jìn)行多種不同蛋白的表達(dá)。由于其靈活性高，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染非常適用于提供數(shù)量少但是種類繁多的蛋白小規(guī)模生產(chǎn)供應(yīng)，或者是創(chuàng)新藥物蛋白早期的表達(dá)篩選[4-5]。當(dāng)然瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)的表達(dá)量相對(duì)較低、放大時(shí)較大量的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑會(huì)限制放大工藝的進(jìn)行等問題，行業(yè)也非常關(guān)注。本文對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)的細(xì)胞系及構(gòu)建載體、轉(zhuǎn)染試劑、工藝優(yōu)化及培養(yǎng)放大現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1 表達(dá)系統(tǒng)

1.1 HEK293 表達(dá)系統(tǒng)

自 1977年Graham 等[6]建立人類胚胎腎（human embryonic kidney cell，HEK）293 細(xì)胞系以來，其已成為世界上最常用的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞株之一。HEK293 細(xì)胞具有穩(wěn)定性好、轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點(diǎn)，適于進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染放大生產(chǎn)。近幾十年來，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染用的 HEK293 細(xì)胞已形成復(fù)雜的系統(tǒng)，經(jīng)過遺傳修飾或單克隆篩選形成了商業(yè)用或者科研用細(xì)胞，有些細(xì)胞已經(jīng)被淘汰不再使用，也有一些細(xì)胞需被授權(quán)才能使用。

早期 HEK293 貼壁培養(yǎng)時(shí)主要使用 DMEM 添加 10% 胎牛血清，倍增時(shí)間為 24～36 h，主要適用于小規(guī)模培養(yǎng)。隨著技術(shù)發(fā)展，進(jìn)行大規(guī)模懸浮培養(yǎng)時(shí)，需使用無 血清、無蛋白、化學(xué)成分限定的培養(yǎng)基，在不進(jìn)行補(bǔ)料情 況下，通常 HEK293 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)最大細(xì)胞密度可達(dá) 8 × 106個(gè)/ml。一般小量懸浮培養(yǎng)時(shí)使用三角瓶，體積 100～300 ml 不等，大量懸浮培養(yǎng)時(shí)需使用生物反應(yīng)器，體積幾升到幾百升不等[7]。

HEK293 家族有多種不同的細(xì)胞系，不同的蛋白在同一細(xì)胞系中的表達(dá)情況不同，同一蛋白在不同的細(xì)胞系中表達(dá)情況也不同。如果一個(gè)蛋白在一種宿主細(xì)胞系中表達(dá)水平較差，可嘗試其他宿主細(xì)胞系進(jìn)行表達(dá)。Geisse[8]總結(jié)了 6 種不同的 HEK293 細(xì)胞系的特點(diǎn)以及小量表達(dá) 14 種不同的蛋白的表達(dá)量，均為懸浮培養(yǎng)，6 孔板轉(zhuǎn)染，每孔 2 ml，包括 7 μl 轉(zhuǎn)染試劑、2 μg 質(zhì)粒、1 × 106個(gè)細(xì)胞。結(jié)果顯示，14 種蛋白在不同 HEK293 系統(tǒng)中的表達(dá)水平在 1～40 mg/L 之間，比較同一蛋白在 6 種 HEK293 細(xì)胞中的表達(dá)量差異，HEK293-6E（NRC）的表達(dá)量較高。常見的瞬時(shí)表達(dá)用 HEK293 細(xì)胞的特性如表1所示。

1.2 CHO 表達(dá)系統(tǒng)

最早的 CHO 細(xì)胞是 1956年由 Theodore Puck 從來源于一個(gè)部分同系交配的中國倉鼠的卵巢細(xì)胞分離獲得的一個(gè)自發(fā)永生化的成纖維細(xì)胞群[9]。CHO 細(xì)胞為上皮貼壁型細(xì)胞，具有不死性，可以傳代百代以上，是生物工程上廣泛使用的細(xì)胞。另外，CHO 屬于成纖維細(xì)胞，是一種非分泌型細(xì)胞，它本身很少分泌 CHO 內(nèi)源蛋白，因此對(duì)目標(biāo)蛋白分離純化工作十分有利。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)可形成有活性的二聚體，具有糖基化的功能，是表達(dá)復(fù)雜生物大分子的 理想宿主。目前，重組蛋白生產(chǎn)上通常使用的 CHO 細(xì)胞系有 3 種：①從 1957年得到的 CHO 細(xì)胞群通過單細(xì)胞克隆得到的 CHO-K1（即野生型 CHO 細(xì)胞），CHO-S 為 CHO-K1 馴化后的懸浮細(xì)胞；②敲除 CHO-K1 的二氫葉酸還原酶（DHFR）等位基因得到的CHO-DXB11；③通過電離輻射 CHO 細(xì)胞群得到兩個(gè) DHFR 等位基因都被敲除的CHO-DG44。雖然 CHO 細(xì)胞還有很多其他的衍生細(xì)胞系，但是目前進(jìn)行 CHO 細(xì)胞系的改造，多以這 3 種為初始細(xì)胞。目前市面上商品化的 CHO 細(xì)胞圖譜如圖1所示，常見的瞬時(shí)表達(dá)用 CHO 細(xì)胞的特性如表2所示。

表1 瞬時(shí)表達(dá)用 HEK293 細(xì)胞系和表達(dá)系統(tǒng)匯總[8]

圖1 商品化 CHO 細(xì)胞系圖譜

表2 瞬時(shí)表達(dá)用 CHO 細(xì)胞系和表達(dá)系統(tǒng)匯總[10]

2 轉(zhuǎn)染試劑

目前，將外源 DNA 導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法大致可分為兩大類，即生物方法和物理化學(xué)方法。生物方法主要以病毒作為載體，通過病毒感染的方式將外源 DNA 導(dǎo)入到細(xì)胞中，其中以逆轉(zhuǎn)錄病毒及腺病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)最為常用。物理化學(xué)方法中常用的有磷酸鈣法、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、顯微注射、電穿孔，以及最近出現(xiàn)的以高分子聚合物為載體的基因傳遞技術(shù)。其中最常用的是化學(xué)方法，磷酸鈣、聚乙烯亞胺（PEI）、脂質(zhì)體等化學(xué)試劑較為常用。

2.1 磷酸鈣

磷酸鈣是使用超過 30年的哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑[11]，可用于 HEK293 細(xì)胞轉(zhuǎn)染。此方法操作簡單，主要包括 2 個(gè)步驟：① DNA 質(zhì)粒和氯化鈣溶液混合；②加入磷酸鹽緩沖液形成 CaPi-DNA 復(fù)合物。Coonrod 等[12]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后 1 h，質(zhì)粒 DNA 已經(jīng)到達(dá)細(xì)胞核周圍區(qū)域，當(dāng)進(jìn)行有絲分裂細(xì)胞核膜溶解時(shí)，質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞核。Batard 等[13]使用疊氮溴乙錠和熒光肽核酸標(biāo)簽標(biāo)記質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)每個(gè)細(xì)胞可以轉(zhuǎn)進(jìn)約 1 000 000 個(gè)質(zhì)粒，加入培養(yǎng)體系的質(zhì)粒，只有 5% 可轉(zhuǎn)進(jìn)細(xì)胞核內(nèi)。

磷酸鈣轉(zhuǎn)染，CaPi-DNA 復(fù)合物的形成是動(dòng)態(tài)可逆的過程，轉(zhuǎn)染的過程需要注意多個(gè)參數(shù)，如細(xì)胞密度、磷酸鹽緩沖液的 pH、質(zhì)粒濃度、氯化鈣濃度、磷酸鹽濃度等。盡管磷酸鈣轉(zhuǎn)染已可以放大到 100 L 的規(guī)模，但是也存在著較 大的缺點(diǎn)：一是需要添加血清和白蛋白以降低 CaPi 的毒性，二是需要換液，所以目前此方法應(yīng)用并不廣泛。

2.2 PEI

2.2.1 作用原理 目前使用最廣泛的陽離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑是 PEI。PEI 制備簡單，價(jià)格便宜，有線狀和枝狀兩種商業(yè)試劑可選，是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染放大轉(zhuǎn)染試劑的不二選擇。自 19世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn) PEI 可以結(jié)合 DNA 質(zhì)粒，直到 20年后，PEI 才真正用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染，成為非常有潛力的非病毒質(zhì)粒載體試劑。由于 PEI 帶正電荷，與帶負(fù)電荷的 DNA 結(jié)合形成帶正電荷的 PEI-DNA 復(fù)合物，可以與帶負(fù)電荷的細(xì)胞表面結(jié)合。PEI-DNA 復(fù)合物通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部形成內(nèi)涵體，之后一部分從內(nèi)涵體中逃逸進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，未逃逸的進(jìn)入溶酶體被降解，無法入核的 DNA 會(huì)在 100 min 內(nèi)被胞漿中的 DNA 酶降解（圖2）[14-15]。每毫升轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒混合物形成約 1 × 1010個(gè) DNA/PEI 復(fù)合物，大小為 300 nm 左右。經(jīng)過 15 min 孵育，轉(zhuǎn)染時(shí)每個(gè)細(xì)胞進(jìn)入約 250 個(gè) DNA/PEI 復(fù)合物[16-17]。

圖2 PEI 轉(zhuǎn)染機(jī)制

2.2.2 不同 PEI 的比較 枝狀的 800 kD PEI 是首次報(bào)道的可用于多種細(xì)胞轉(zhuǎn)染的試劑，枝狀的 25 kD PEI（25B）用于 HEK293 細(xì)胞大規(guī)模瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，其轉(zhuǎn)染效率較枝狀 2 kD、600 kD、800 kD 或線狀 22 kD PEI（22L）的高[18]。之后比較了枝狀 70 kD、50～100 kD、25 kD PEI 和線狀 25 kD PEI（25L），結(jié)果表明 25B 和 25L 的轉(zhuǎn)染效率較高，適合于哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染，但是 25L 比 25B 更適用于懸浮哺乳動(dòng)物細(xì)胞 HEK293 和 CHO 轉(zhuǎn)染。Delafosse 等[19]比較了 3 種商品化的 PEI 轉(zhuǎn)染試劑 25 kD LPEI、40 kD PEI-Max、PEI pro，轉(zhuǎn)染 HEK293 和 CHO 細(xì)胞，PEI pro 的轉(zhuǎn)染效率低于 25 kD LPEI、40 kD PEI-Max，PEI pro 的毒性最強(qiáng)。經(jīng)過優(yōu)化，PEI-Max 的表達(dá)量優(yōu)于 25 kD LPEI。

在 HEK293 細(xì)胞，無論是使用搖瓶轉(zhuǎn)染還是大規(guī)模的 Wave 波浪生物反應(yīng)器轉(zhuǎn)染，PEI 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染效率均在 60% 左右。在 CHO 細(xì)胞，PEI 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染相對(duì)數(shù)據(jù)較少，轉(zhuǎn)染效率在 40%～60% 之間。

PEI 介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中 DNA 和 PEI 比例一般為 1:2～1:3（W/W），提高轉(zhuǎn)染試劑比例會(huì)提高轉(zhuǎn)染效率，但是隨之細(xì)胞毒性也會(huì)增加。另外轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度、DNA-PEI 聚合物的大小、培養(yǎng)基的組成等都會(huì)影響轉(zhuǎn)染效果[11]。

2.3 脂質(zhì)體

陽離子脂質(zhì)體易穿透細(xì)胞膜，轉(zhuǎn)染效率要明顯高于其他轉(zhuǎn)染試劑，因而也廣泛用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，但因其化學(xué)合成不易，商業(yè)化常用的脂質(zhì)體如 Lipofectamine 價(jià)格較高，遠(yuǎn)貴于其他化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑，因此只適合于小量瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。目前最常用的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染體系是將陽離子脂質(zhì)體與 DNA 溶液混合，以形成 DNA 夾在脂質(zhì)雙分子層之間的結(jié)構(gòu)。

HEK293 細(xì)胞是非常適合進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，很容易接收外來 DNA，在合適的轉(zhuǎn)染條件下，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率可達(dá) 80% 以上，使用商品化羅氏的 FuGene HD 或者 Invitrogen 的 Lipofectamine2000 的轉(zhuǎn)染效率甚至可達(dá) 90% 以上。但是傳統(tǒng)的 CHO 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較低，只有 40%～60%。近年來 Thermo Fisher 公司新開發(fā)的 Expi293F 和 ExpiCHO 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)量有了較大的提升，但是商品化的轉(zhuǎn)染試劑盒培養(yǎng)基價(jià)格較貴，不太適用于產(chǎn)業(yè)化放大，Jain 等[20]比較了用 Expi293F 和 ExpiCHO 表達(dá)系統(tǒng)表達(dá) 14 種不同蛋白的表達(dá)水平，結(jié) 果表明 ExpiCHO 表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)量優(yōu)于 Expi293F，不同類型的蛋白，表達(dá)量差異比較大，但即使是同一亞型的抗 體，表達(dá)量也有較大差異，ExpiCHO 表達(dá) 4 個(gè) IgG 的 表達(dá)量在 84～3271 mg/L，表達(dá) 3 個(gè)雙特異性抗體的表達(dá)量在 75～398 mg/L，表達(dá) 5 個(gè)融合蛋白的表達(dá)量在 68～894 mg/L。

3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染優(yōu)化

3.1 DOE 實(shí)驗(yàn)

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染優(yōu)化首先考慮的就是影響瞬時(shí)表達(dá)的因素，主要包括轉(zhuǎn)染試劑的類型和濃度、DNA 的濃度、孵育時(shí)間、細(xì)胞類型、培養(yǎng)基類型、細(xì)胞代次、轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度等。這些因素必須綜合考慮，才能達(dá)到最佳的轉(zhuǎn)染條件。最常用的優(yōu)化瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)體系的方法是 DOE 實(shí)驗(yàn)，可以在減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)的情況下，應(yīng)用生物學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法得到較好的結(jié)果。Vink 等[21]建立了一種穩(wěn)定高效瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)表達(dá)抗體，利用 Freestyle 293-F 表達(dá)人重組抗體 IgG 和 Fab，通過 Design-Expert 軟件進(jìn)行 DOE 設(shè)計(jì)，優(yōu)化質(zhì)粒比例，使表達(dá)量從平均的 30 mg/L 提升到 400 mg/L。

3.2 降溫

降溫也是常用的提升 CHO 表達(dá)系統(tǒng)蛋白產(chǎn)量的方法，從常規(guī)的 37 ℃ 培養(yǎng)，到轉(zhuǎn)染后降低至 30～32 ℃。降低溫度可以使細(xì)胞停留在 G1 期，降低代謝速率，同時(shí)提高蛋白產(chǎn)量[22-23]。由于生物反應(yīng)器具有精確的溫度控制系統(tǒng)，因此很容易進(jìn)行放大。據(jù)報(bào)道，已經(jīng)成功放大至 50～100 L[24]。

3.3 添加化學(xué)復(fù)合物

加入化學(xué)復(fù)合物是一種常用的提高轉(zhuǎn)染效率的方法。最常用的是組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDCA）抑制劑，通過解除轉(zhuǎn)錄抑制來提高重組蛋白表達(dá)量。一般在轉(zhuǎn)染后 4 h 加入，此時(shí) DNA 已進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，轉(zhuǎn)錄剛剛 開始。最常用的 HDCA 抑制劑是丙戊酸和丁酸鈉[25]。也有一些試劑可以提高細(xì)胞膜的通透性，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)染效率，如 DMSO 和乙酸鉀，一般在轉(zhuǎn)染前添加[26]。

3.4 共表達(dá)調(diào)節(jié)蛋白

共表達(dá)調(diào)節(jié)蛋白也是一種常用的提高表達(dá)量的方 法[27]。在 HEK293 轉(zhuǎn)染表達(dá)目的蛋白時(shí)，共轉(zhuǎn)染 3 個(gè)調(diào)節(jié)蛋白 P18、P21、αFGF，使活細(xì)胞密度和抗體分泌提升。Zustiak 等[28]共轉(zhuǎn)染了抗細(xì)胞凋亡基因 bcl-xL，以降低細(xì)胞凋亡，提升蛋白表達(dá)。Zhang 等[29]通過共表達(dá)凋亡基因 Bcl-xL 和 Mcl-1，提高了 PD-1 抗體在 CHO 細(xì)胞中的 表達(dá)。

4 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的放大

關(guān)于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的放大報(bào)道較少，原因可能是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)目前還停留在科研階段，生產(chǎn)企業(yè)采用的較少。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的放大主要采用三角瓶、Wave 波浪生物反應(yīng)器和攪拌式生物反應(yīng)器。某些制藥公司也開始嘗試進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的放大，從 0.1 L 開始，轉(zhuǎn)染體積甚至到 80～100 L 規(guī)模[30-31]。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的表達(dá)水平與蛋白的結(jié)構(gòu)有很大關(guān)系，很難進(jìn)行直 接對(duì)比。一般情況下，使用轉(zhuǎn)染試劑 PEI，無論是 HEK293 細(xì)胞還是 CHO 細(xì)胞，表達(dá)水平均在 1～80 mg/L。重組 抗體 IgG 表達(dá)時(shí)，使用 3～150 L 不同體積的反應(yīng)器，不論是批式培養(yǎng)或者流加補(bǔ)料培養(yǎng)，抗體表達(dá)水平均在 2～80 mg/L[26]。也有表達(dá)量較高的報(bào)道，HEK293 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染達(dá)到 1～2 g/L，ExpiCHO 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)量達(dá)到 2 g/L[32-33]。在瞬時(shí)基因表達(dá)工藝的放大中，需確保工藝放大前后細(xì)胞的活性、目的蛋白的產(chǎn)量與質(zhì)量等保持不變[34-35]。不同的培養(yǎng)規(guī)模下，溫度、pH、流加策略一般不改變，但攪拌速度和通氣速率等因素受體積影響，需要遵循一定的變化準(zhǔn)則。轉(zhuǎn)染結(jié)束后，在蛋白表達(dá)過程中添加營養(yǎng)物質(zhì)以延長蛋白的表達(dá)過程，提高重組蛋白表達(dá)量，如加入水解蛋白、進(jìn)行分批補(bǔ)料等。工藝放大（縮小）通常采用相同單位體積 功率 P/V、傳質(zhì)系數(shù) kLa 等作為準(zhǔn)則。Gutiérrez-Granados 等[36]對(duì)使用 PEI 進(jìn)行 HEK293 和 CHO 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染放大的工藝進(jìn)行了總結(jié)，包括生物反應(yīng)器放大時(shí)的參數(shù)控制，轉(zhuǎn)速、pH、DO 等物理參數(shù)以及轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度、質(zhì)粒量和質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑的比例等，從而實(shí)現(xiàn)放大的產(chǎn)能增加，質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑的最優(yōu)比從 1:1.5～1:4.5 不等，表達(dá)量從 1 mg/L～1 g/L 不等。

5 展望

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)技術(shù)主要用于快速獲得毫克級(jí)別到克級(jí)別的蛋白。盡管現(xiàn)在穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建篩選已經(jīng)非常成熟，且表達(dá)量較高，但是對(duì)于一些特殊的應(yīng)用，仍需要瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)，如基因治療、體外診斷試劑、個(gè)性化藥物、VLP 蛋白、疫苗等的生產(chǎn)[37-41]，甚至還用來大量表達(dá)膜蛋白[42]。影響瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)的因素主要有以下幾個(gè)方面：細(xì)胞系的選 擇、表達(dá)載體的選擇、質(zhì)粒 DNA 的質(zhì)量、轉(zhuǎn)染試劑、培養(yǎng)基和補(bǔ)料方法[43]，需要同時(shí)進(jìn)行多個(gè)方面的優(yōu)化，才能實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的高表達(dá)。經(jīng)過多年的技術(shù)發(fā)展，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染關(guān)鍵參數(shù)的優(yōu)化取得了一定的成績，如細(xì)胞系、表達(dá)載體、轉(zhuǎn)染試劑、培養(yǎng)基等，且由于表達(dá)載體和培養(yǎng)基方面的研究 進(jìn)展，目前 CHO 重組蛋白的瞬時(shí)表達(dá)水平已經(jīng)達(dá)到1～2 g/L，雖與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)的 3～10 g/L 仍有一定差距，但瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)的自身優(yōu)勢也在促使其不斷的發(fā)展。