徐曉琴，陳良，張娟，孫宇，卿德剛，倪慧

(1.新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，烏魯木齊 830002；2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，烏魯木齊 830000)

意大利牛舌草(AnchusaitalicaRetz.)又名牛舌草[1]“高孜萬(wàn)”[2]，源于紫草科牛舌草屬植物，主要分布于地中海和熱帶地區(qū)[3]，為維吾爾醫(yī)臨床常用藥，收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》維藥分冊(cè)中，全草入藥，具有生濕生熱、潤(rùn)燥消炎、止咳平喘等功效，廣泛用于心血管疾病與呼吸系統(tǒng)疾病的治療，如肺炎、高血壓、結(jié)核病、寒性咳嗽、感冒等[4]，是維吾爾醫(yī)經(jīng)典復(fù)方不可缺少的主藥之一[5]。意大利牛舌草含有揮發(fā)油、黃酮類(lèi)、三萜類(lèi)、酚類(lèi)和生物堿類(lèi)等多種成分[6]，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)其具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用、內(nèi)分泌作用以及保護(hù)心血管等藥理活性[5]，但是，在抗炎、鎮(zhèn)咳、體外抑菌等方面的研究較少，本課題組基于意大利牛舌草的臨床應(yīng)用，對(duì)不同提取物展開(kāi)活性評(píng)價(jià)，篩選其有效部位，為闡明意大利牛舌草抗炎、鎮(zhèn)咳的藥理作用及發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)，體質(zhì)量150～180 g，110只，雄性；昆明種小鼠，SPF級(jí)，18～22 g，100只，雌雄各半，購(gòu)自新疆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(新)2016-0007。在溫度為20～24 ℃、相對(duì)濕度為40%～60%、12 h光照交替的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由攝食飲水。

1.2儀器 Mettler Toledo AB265-S電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司，感量：0.1 mg)；UPT-I-5T優(yōu)普超純水儀(成都純化科技有限公司)；YLS-8A多功能誘咳引喘儀(濟(jì)南益延科技有限公司)；BSC-1300II A/ B3生物安全柜(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；KXQ.SG46.280高壓滅菌鍋(上海佳騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；JM300/0.1電子天平(余姚紀(jì)銘稱(chēng)重校驗(yàn)設(shè)備有限公司，感量：0.1 mg)。

1.3材料 意大利牛舌草(批號(hào)：15120405，新疆奇康哈博中維藥飲片有限公司，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)李永和教授鑒定，符合維吾爾藥地方標(biāo)準(zhǔn)要求)；意大利牛舌草提取物(實(shí)驗(yàn)室自制，含蘆丁0.52%)；角叉菜膠(Sigma公司，25 g，批號(hào)：SLBR0530V)；醋酸地塞米松片(天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司，批號(hào)：141014，規(guī)格：每片0.75 mg)；急支糖漿(太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠(chǎng)有限公司，規(guī)格：200 mL)；左氧氟沙星(武漢精細(xì)化工，批號(hào)：1502102)；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(青島日水生物有限責(zé)任公司，批號(hào)：20150204)；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(青島日水生物有限責(zé)任公司，批號(hào)：20160601)；二甲亞砜(SIGMA-VETEC公司，批號(hào)：WXDB2507V)。

菌株：大腸埃希菌(ATCC25922)；銅綠假單胞菌(ATCC27853)；金黃色葡萄球菌(ATCC25923)；白念珠菌[CMCC(F)98001]；枯草芽孢桿菌(CMCC63501)，以上菌株購(gòu)自新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗(yàn)所。

1.4意大利牛舌草提取物的制備 取干燥的意大利牛舌草8.0 kg，粉碎成粗粉，以25倍量體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇溶液加熱回流提取1.5 h，提取2次，濾過(guò)，收集合并提取液，低溫濃縮至完全無(wú)醇味，取適量濃縮干燥得到乙醇粗提物(提取率17.37%)；剩余藥液分批取適量，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇溶劑萃取(其提取率分別為0.50%，0.48%，0.74%，3.88%)，收集各部位萃取液及水溶液減壓回收溶劑，干燥得到不同萃取部位浸膏，其中乙酸乙酯、正丁醇、水溶物中蘆丁含量分別為0.32%，1.57%，0.17%。

1.5不同提取物抗炎實(shí)驗(yàn) 采用大鼠足趾腫脹急性炎癥模型[7-8]，將SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表分為11組，每組10只，分別為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、地塞米松組(醋酸地塞米松5 mg·kg-1)，以及乙醇粗提物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水溶物的大、小劑量組(按生藥量計(jì)為2.52，0.63 g·kg-1)，按10 mL·kg-1容積每日灌胃1次，空白對(duì)照組給予等量0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)給藥7 d，末次給藥1 h后用千分尺測(cè)定每只大鼠右后足趾厚度，然后在右后腳跖皮下注射1%角叉菜膠溶液0.1 mL，空白對(duì)照組注射等容積0.9%氯化鈉溶液，分別于注射后0.5，1，2，4，6 h測(cè)量大鼠右后足趾厚度，按下式計(jì)算足趾腫脹度(mm)。

腫脹度(mm)=致炎后足趾厚度-致炎前足趾厚度。

1.6不同提取物鎮(zhèn)咳實(shí)驗(yàn) 取咳嗽敏感小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表分成10組[9-10]，每組10只，分別為空白對(duì)照組(0.9%氯化鈉溶液，30 mL·kg-1)，急支糖漿組(急支糖漿，13 g·kg-1)，以及乙醇粗提物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水溶物大、小劑量組(按生藥量計(jì)為3.04，0.90 g·kg-1)，每天灌胃給藥1次，連續(xù)5 d，灌胃體積均為0.2 mL·(10 g)-1，第5天給藥1 h后，將小鼠逐一放入誘咳引喘儀的密閉干燥籠具內(nèi)，恒壓噴入體積分?jǐn)?shù)為25%濃氨水氣霧，噴霧4 s引咳，觀(guān)察記錄咳嗽潛伏期及2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)，比較不同提取物的鎮(zhèn)咳作用?？人詷?biāo)準(zhǔn)：腹肌收縮，同時(shí)張大嘴，有時(shí)有咳聲，若潛伏期<1 min，且在1 min內(nèi)出現(xiàn)3次以上典型咳嗽者為敏感動(dòng)物，否則淘汰。

1.7不同提取物體外抑菌實(shí)驗(yàn)

1.7.1菌懸液的配置 取檢測(cè)菌凍存液，37 ℃復(fù)蘇，取凍存液10 μL加入營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基5 mL中，37 ℃搖床擴(kuò)大培養(yǎng)12 h，經(jīng)平板分離后用無(wú)菌接種環(huán)挑選單菌落，加入營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基50 mL，培養(yǎng)16 h，麥?zhǔn)媳葷岱ù_定菌液濃度至0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)液。

1.7.2藥物配置 稱(chēng)取4種提取物干粉各2.56 g，分別溶于營(yíng)養(yǎng)肉湯10 mL中，乙酸乙酯提取物溶于含4%二甲亞砜的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基10 mL中，攪拌混勻，115 ℃，30 min滅菌。按兩倍梯度稀釋后并按1：1與含菌液培養(yǎng)基混合，配置左氧氟沙星濃度為128，64，32，16，8，4，2，1和0.5 mg·mL-1的溶液。

1.7.3左氧氟沙星(陽(yáng)性藥)配置 按兩倍梯度稀釋法，配置左氧氟沙星濃度為128，64，32，16，8，4，2，1和0.5 μg·mL-1的溶液。

1.7.4體外抑菌實(shí)驗(yàn) 采用試管稀釋法，取配制好的濃度藥液加入試管每管3 mL，每管加待測(cè)菌液3 mL，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。結(jié)果判定以肉眼觀(guān)察，以試管中無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)者藥物最低濃度為該實(shí)驗(yàn)菌最小抑菌濃度(MIC)，如藥物高濃度組顏色較深無(wú)法觀(guān)測(cè)時(shí)，取藥物前3個(gè)稀釋度做涂布觀(guān)測(cè)；吸取未長(zhǎng)菌試管培養(yǎng)液，每皿100 μL涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，續(xù)培養(yǎng)48 h后觀(guān)察菌的生長(zhǎng)情況，無(wú)菌生長(zhǎng)平板所含的最低藥物濃度即為最低殺菌濃度值(MBC)。

2 結(jié)果

2.1抗炎實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠足趾腫脹度顯著增加(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，0.63，2.52 g·kg-1意大利牛舌草乙醇提取物組在致炎后2 h內(nèi)各時(shí)間段抑制大鼠足趾腫脹程度顯著(P<0.01)；2.52 g·kg-1乙酸乙酯與正丁醇組在致炎后的4 h各時(shí)間段內(nèi)抑制大鼠足趾腫脹程度顯著(P<0.01)，見(jiàn)表1。

2.2鎮(zhèn)咳實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在延長(zhǎng)咳嗽潛伏期方面，與模型對(duì)照組比較，急支糖漿組、乙酸乙酯大劑量組，正丁醇大、小劑量組實(shí)驗(yàn)小鼠的咳嗽潛伏期均延長(zhǎng)(P<0.05)；乙醇提取物大、小劑量組及正丁醇大劑量組的延長(zhǎng)潛伏期作用與急支糖漿組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；在減少咳嗽次數(shù)方面，急支糖漿組，乙醇提取物大劑量組，乙酸乙酯及正丁醇大、小劑量組，水溶物大劑量組實(shí)驗(yàn)小鼠的咳嗽次數(shù)均減少，其中乙酸乙酯大劑量組與正丁醇大劑量組咳嗽次數(shù)較急支糖漿組明顯減少(P<0.01)，見(jiàn)表2。

2.3體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由平板計(jì)數(shù)驗(yàn)證的菌落數(shù)均在范圍內(nèi)，則工作液濃度約為106cfu·mL-1，符合營(yíng)養(yǎng)肉湯稀釋法前提條件，見(jiàn)表3。意大利牛舌草4種不同提取物對(duì)5種菌株的抑制能力不同。見(jiàn)表4。

表1 不同極性提取物對(duì)大鼠足趾腫脹度的影響

組別劑量/(g·kg-1)足趾腫脹度0.5 h1 h2 h4 h6 h空白對(duì)照組—1.68±0.38?11.26±0.6?11.01±0.30?1?20.32±0.32?10.09±0.17?1模型對(duì)照組—2.55±0.25?32.40±0.34?32.37±0.31?31.35±0.27?30.47±0.29?2地塞米松組51.27±0.41?11.52±0.41?11.30±0.12?10.46±0.20?10.12±0.22?4乙醇 小劑量組0.631.57±0.59?11.89±0.71?41.91±0.42?4?31.05±0.64?30.46±0.59?2 大劑量組2.521.36±0.32?11.76±0.40?11.68±0.56?10.86±0.53?4?20.32±0.34乙酸乙酯 小劑量組0.632.14±0.40?31.95±0.61?4?21.91±0.64?4?31.22±0.55?30.31±0.28 大劑量組2.521.80±0.79?1?21.53±0.13?11.68±0.42?10.94±0.60?1?20.18±0.20?4正丁醇 小劑量組0.631.96±0.64?1?32.15±0.57?32.03±0.71?31.14±0.46?30.18±0.24?4 大劑量組2.521.68±0.43?11.74±0.27?11.68±0.25?1?20.95±0.31?1?20.14±0.19?4水溶物 小劑量組0.631.70±0.33?12.10±0.44?32.13±0.27?31.50±0.51?30.52±0.34?3 大劑量組2.521.85±0.54?1?32.07±0.35?21.98±0.41?4?31.24±0.43?1?20.24±0.21

與模型對(duì)照組同一時(shí)間點(diǎn)比較，*1P<0.01，*4P<0.05；與地塞米松組同一時(shí)間點(diǎn)比較，*2P<0.05，*3P<0.01

Compared with model control group at the same time point,*1P<0.01，*4P<0.05; Compared with dexamethasone group at the same time point,*2P<0.05,*3P<0.01

表2 各組小鼠對(duì)濃氨水致咳嗽反應(yīng)

組別劑量/(g·kg-1)咳嗽潛伏期/s2 min咳嗽次數(shù)模型對(duì)照組-30.87±6.44?145.35±10.04?1急支糖漿組1340.47±2.29?236.77±9.60?2乙醇 小劑量組0.9027.33±7.49?337.15±8.92 大劑量組3.0429.83±3.61?137.03±9.35?2乙酸乙酯 小劑量組0.9032.97±12.9430.87±6.67?4 大劑量組3.0441.74±9.15?221.93±5.46?3?4正丁醇 小劑量組0.9041.42±14.23?232.37±10.15?4 大劑量組3.0451.95±12.62?1?424.22±7.02?3?4水溶物 小劑量組0.9032.90±11.4839.00±10.43 大劑量組3.0439.47±10.5336.4±6.69?2

與急支糖漿組比較，*1P<0.05，*3P<0.01；與模型對(duì)照組比較，*2P<0.05，*4P<0.01

Compared withjizhisyrup group,*1P<0.05，*3P<0.01; Compared with model control group,*2P<0.05，*4P<0.01

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典的角叉菜膠致大鼠足趾腫脹模型評(píng)價(jià)意大利牛舌草各提取部位的抗炎藥理活性。在模型建立過(guò)程中，模型對(duì)照組大鼠足趾腫脹度較空白對(duì)照組顯著增加，表明大鼠足趾腫脹模型造模成功，致炎后大鼠足趾發(fā)生炎癥，腫脹度隨時(shí)間發(fā)生相應(yīng)的變化。致炎0.5 h后，空白對(duì)照組與模型對(duì)照組腫脹度值達(dá)到高峰，0.5～2 h內(nèi)，腫脹度值變化較小，而在4 h后兩組的腫脹度值均開(kāi)始回落，空白對(duì)照組在6 h后腫脹逐漸恢復(fù)正常，模型對(duì)照組值在6 h后回落明顯，考慮與角叉菜膠所致機(jī)體的急性炎癥反應(yīng)有關(guān)，此結(jié)果與國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道接近[12]。

本研究顯示，意大利牛舌草乙醇提取部位(0.63，2.52 g·kg-1)在致炎后2 h抑制大鼠足趾腫脹程度顯著(P<0.01)，2.52 g·kg-1劑量組在致炎4 h內(nèi)抑制炎癥作用與醋酸地塞米松組作用相當(dāng)，正丁醇部位與乙醇部位的抑制炎癥效果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示乙醇粗提取部位及正丁醇部位具有抗炎活性；小鼠鎮(zhèn)咳實(shí)驗(yàn)反應(yīng)，乙醇提取物組(3.04，0.90 g·kg-1)與正丁醇部位組(3.04 g·kg-1)延長(zhǎng)小鼠咳嗽潛伏期作用與急支糖漿組作用相當(dāng)(P<0.05或P<0.01)，并且乙醇提取部位、正丁醇部位3.04 g·kg-1劑量組咳嗽次數(shù)明顯減少(P<0.05)，此結(jié)果提示意大利牛舌草乙醇提取部位、正丁醇部位均具有鎮(zhèn)咳作用；二倍試管稀釋法篩選不同提取物的抑菌活性實(shí)驗(yàn)顯示，4種意大利牛舌草提取物分別對(duì)枯草芽孢桿菌具有抑菌活性，其中乙酸乙酯部位與水溶部位的抑制水平較其他部位明顯。

表3 菌液稀釋液濃度驗(yàn)證結(jié)果

表4 牛舌草提取物對(duì)5種菌株MIC和MBC結(jié)果

Tab.4MICandMBCofextractsofAnchusaitalicaRetz.onfivestrainsmg·mL-1

組別大腸埃希菌MICMBC金黃色葡萄球菌MICMBC枯草芽孢桿菌MICMBC銅綠假單胞菌MICMBC白念珠菌MICMBC左氧氟沙星組0.5×10-30.5×10-30.5×10-30.5×10-30.5×10-31×10-31×10-34×10-30.5×10-32×10-3乙醇提取物組>128>12864>12832128>128>128>128>128乙酸乙酯提取物組>128>128>128>12843264>128>128>128正丁醇提取物組>128>128>128>128>128>128>128>12864>128水溶物組>128>128>128>12846464>128128>128

本研究表明，意大利牛舌草乙醇粗提物具有抗炎、鎮(zhèn)咳的藥理活性，其正丁醇部位的活性較其他部位明顯，并且與乙醇粗提取物的作用相當(dāng)，在有效物質(zhì)提取富集方面，正丁醇部位的提取率均高于其他極性部位，提示意大利牛舌草提取物在抗炎、鎮(zhèn)咳方面顯現(xiàn)出藥理活性，值得深入研究。