王 旭，王丹生，羅永成

(遼東學(xué)院農(nóng)學(xué)院，遼東學(xué)院海岸帶生物技術(shù)研究所，遼寧丹東 118003)

水霉病具有高度傳染性，發(fā)病率及死亡率高，各種淡水成魚(yú)、稚魚(yú)和魚(yú)卵都可發(fā)生，是淡水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的世界性病害[1]。該病病原為水霉屬真菌[2]。其中，寄生水霉Saprolegnia parasitica 是目前已發(fā)現(xiàn)的致病水霉中最為重要的病原菌，其孢子萌發(fā)快，侵襲能力強(qiáng)，幾乎能夠感染包括鯽、斑馬魚(yú)、鱘及鱸魚(yú)等在內(nèi)的所有淡水魚(yú)類(lèi)及卵[3-6]?？兹甘G曾是治療水霉病最有效的化學(xué)試劑，但因其強(qiáng)致畸、致癌及高殘留，已被禁止使用。目前水霉病防治主要采用抗生素、殺菌劑、中草藥和氧化劑等[7-13]。這些方法易造成水霉的耐藥性，且存在效果不明顯、成本高，使用受限，有效濃度超出安全限量等問(wèn)題[14]。研究表明，一些微生物來(lái)源的活性成分可以抑制真菌的生長(zhǎng)和感染，且具有綠色、環(huán)保、安全、高效的優(yōu)點(diǎn)[15-17]。本試驗(yàn)以寄生水霉為靶標(biāo)菌，通過(guò)平板對(duì)峙培養(yǎng)篩選對(duì)水霉生長(zhǎng)具有抑制作用的菌株，并對(duì)其安全性和抑菌穩(wěn)定性進(jìn)行初步分析，以期為水霉病的生物防治提供優(yōu)良菌種資源和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

寄生水霉菌株SMJ-1、SMJ-2、SMJ-3、SMJ-4 分別由筆者分離自遼寧省東港市淡水養(yǎng)殖池塘的散鱗鏡鯉Cyprinus carpio var.specularis、彭澤鯽Carassius auratus var.pengze、大鱗副泥鰍Paramisgurnus dabryanus 的發(fā)病組織及散鱗鏡鯉魚(yú)卵。經(jīng)純化、致病性測(cè)定和分子鑒定，確定其均為寄生水霉。待篩選菌株為筆者分離自丹東地區(qū)淡水養(yǎng)殖池塘周?chē)寥罉悠分械?1 株放線(xiàn)菌。所有菌株均保存于遼東學(xué)院農(nóng)學(xué)院微生物工程實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、瓊脂20.0 g、水1 000 mL，自然pH 值，用于寄生水霉的培養(yǎng)和平板對(duì)峙試驗(yàn)；高氏一號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉20.0 g，硝酸鉀1.0 g，氯化鈉0.5 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂20.0 g，水1 000 mL，pH 7.2，用于放線(xiàn)菌傳代培養(yǎng)；ISP1 培養(yǎng)基：酪蛋白胨5 g，酵母提取物3，pH 6.8～7.2，用于拮抗菌液體培養(yǎng)。

1.1.3 試驗(yàn)用魚(yú)

試驗(yàn)用散鱗鏡鯉、彭澤鯽和大鱗副泥鰍稚魚(yú)由丹東市水產(chǎn)科學(xué)研究所提供。其中，散鱗鏡鯉平均體長(zhǎng)4.45±0.75 cm、體質(zhì)量2.08±0.43 g，彭澤鯽平均體長(zhǎng)4.82±0.57 cm、體質(zhì)量1.64±0.36 g，大鱗副泥鰍平均體長(zhǎng)9.54±0.52 cm、體質(zhì)量8.33±1.51 g。

1.1.4 主要試劑

Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR、Premix Taq Version 2.0 (Loading dye mix)、DNA Marker(DL-2000)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，引物1492R/27F(1492R：5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’；27F：5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌篩選

采用平板對(duì)峙法進(jìn)行初篩，將活化后的寄生水霉用直徑0.6 cm 的無(wú)菌打孔器制備菌餅，接種于PDA平板中央，18 ℃培養(yǎng)24 h 后，采用十字交叉法，在距離靶標(biāo)菌餅2 cm 處對(duì)稱(chēng)接種待篩選菌株，以不接菌一側(cè)為對(duì)照。置于18 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至對(duì)照一側(cè)長(zhǎng)滿(mǎn)平板后測(cè)量抑菌帶寬度，確定待篩菌株的抑菌效果。

采用發(fā)酵液抑菌試驗(yàn)確定其抑菌率，將初篩所得拮抗菌接種于裝量為40%的ISP1 液體培養(yǎng)基中，28 ℃發(fā)酵72 h。發(fā)酵液經(jīng)微孔濾膜(孔徑0.22 μm)過(guò)濾后，按照1 :5 的比例與55 ℃的PDA 培養(yǎng)基混合均勻，制備平板。冷卻后，在平板中央接種寄生水霉菌餅，設(shè)無(wú)菌水為對(duì)照，每個(gè)處理3 次重復(fù)，于18 ℃培養(yǎng)至對(duì)照長(zhǎng)滿(mǎn)平板后，測(cè)量各處理的菌落直徑，計(jì)算抑菌率。抑菌率(%)=(對(duì)照菌落生長(zhǎng)直徑-處理菌落生長(zhǎng)直徑/對(duì)照菌落生長(zhǎng)直徑)×100。

1.2.2 拮抗菌鑒定

拮抗菌形態(tài)特征測(cè)定參照文獻(xiàn)[18-19]的方法進(jìn)行。拮抗菌16S rRNA 基因序列分析方法如下：將待測(cè)菌株接種在高氏一號(hào)平板培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3 d，用滅菌的槍頭刮取適量菌體置于50 μL 菌體裂解液Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR 中，80 ℃水浴15 min，5 000 r·min-1離心5 min，取上清液作為PCR 模板。選用通用引物27F：5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’和1492R：5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’進(jìn)行16SrRNA 基因擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為：1×Taq PCR Master Mix 25 μL，DNA 模板2 μL (1～10 ng)，引物(10 μmol·L-1)各1 μL，ddH2O 21 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃，4 min；94 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，2 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min，4 ℃終止反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后，由生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行純化、測(cè)序拼接。獲得的基因序列在NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov)進(jìn)行Blast 檢測(cè)，下載同源性較高的菌種序列，用Clustal X 2.0 程序進(jìn)行多重序列比對(duì)，利用MEGA 7.0 軟件的鄰接法(Neighbor-joining method)進(jìn)行1 000 次步長(zhǎng)計(jì)算，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[20]。

1.2.3 拮抗菌安全性測(cè)定

拮抗菌發(fā)酵濾液的制備方法同1.2.1。試驗(yàn)用魚(yú)室內(nèi)暫養(yǎng)7 d 后進(jìn)行試驗(yàn)。每種魚(yú)分別設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)選取30 尾稚魚(yú)。實(shí)驗(yàn)組加入拮抗菌發(fā)酵濾液原液(與水體體積比為1 :10)，對(duì)照組加入等量滅菌的ISP1 培養(yǎng)基。試驗(yàn)期間水溫(24±2) ℃，充氣使溶解氧不低于6 mg·L-1，氨氮和亞硝酸鹽濃度不高于0.1 mg·L-1，光周期為自然周期，7 d 后統(tǒng)計(jì)稚魚(yú)存活率，根據(jù)稚魚(yú)存活率分析拮抗菌的安全性。

1.2.4 拮抗菌傳代穩(wěn)定性測(cè)定

拮抗菌株于高氏一號(hào)培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)，每48 h 轉(zhuǎn)接1 次，連續(xù)傳代10 次，每個(gè)處理3 次重復(fù)。平板對(duì)峙試驗(yàn)測(cè)定出發(fā)菌株與傳代菌株對(duì)寄生水霉的抑菌效果，根據(jù)抑菌帶寬度變化分析傳代對(duì)拮抗菌抑菌效果的影響。

1.2.5 拮抗菌發(fā)酵液熱穩(wěn)定性測(cè)定

拮抗菌發(fā)酵采用ISP1 液體培養(yǎng)基，以5%的接種量，將拮抗菌菌液接種于裝量為40%的500 mL 三角瓶中，28 ℃，120 r·min-1，培養(yǎng)72 h。發(fā)酵液采用微孔濾膜(孔徑0.22 μm)過(guò)濾，濾液4 ℃冷藏備用。

各取發(fā)酵濾液15 mL 分別加入到20 mL 直口離心管中，置于10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃下處理2 h。之后按照1 :5 的比例，將處理后的發(fā)酵濾液分別與滅菌后冷卻至55 ℃的PDA 培養(yǎng)基混合均勻制備平板。每個(gè)平板中央接種寄生水霉菌餅，每個(gè)處理重復(fù)3 次，設(shè)無(wú)菌水為對(duì)照18 ℃培養(yǎng)至對(duì)照長(zhǎng)滿(mǎn)平板后，測(cè)量各處理菌落直徑，計(jì)算抑菌率，分析不同溫度處理對(duì)試驗(yàn)菌株發(fā)酵濾液抑菌活性的影響。

1.2.6 拮抗菌發(fā)酵液酸堿穩(wěn)定性測(cè)定

拮抗菌發(fā)酵濾液的制備方法同1.2.5。各取發(fā)酵濾液15 mL 分別加入到20 mL 直口離心管中，用1 mol·L-1HCl 和1 mol·L-1NaOH 分別調(diào)整pH 至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，室溫靜置24 h 后，將各管中的pH調(diào)回至未經(jīng)處理的發(fā)酵濾液pH 6.8。之后按照1 :5 的比例，將處理后的發(fā)酵濾液分別與滅菌后冷卻至55 ℃的PDA 培養(yǎng)基混合均勻制備平板。每個(gè)平板中央接種寄生水霉菌餅，每個(gè)處理重復(fù)3 次，18 ℃培養(yǎng)至對(duì)照長(zhǎng)滿(mǎn)平板后，測(cè)量各處理菌落直徑，計(jì)算抑菌率，分析不同pH 處理對(duì)試驗(yàn)菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌篩選

平板對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株FX11 對(duì)4 株不同來(lái)源的寄生水霉菌株SMJ-1、SMJ-2、SMJ-3、SMJ-4均表現(xiàn)出明顯拮抗作用，其中抑菌帶平均寬度最大為18.30±1.52 mm，見(jiàn)圖1。發(fā)酵液抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株FX11 的抑菌率為68.40%。

2.2 拮抗菌鑒定

2.2.1 拮抗菌FX11 的形態(tài)特征

菌株FX11 在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上菌落微黃色、干燥，基內(nèi)菌絲淺黃色，氣生菌絲黃白色，無(wú)可溶性色素，見(jiàn)圖2。孢子絲直、長(zhǎng)。分生孢子柱形或卵圓形，表面光滑，見(jiàn)圖3、4。對(duì)照《放線(xiàn)菌的分類(lèi)與鑒定》和《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》，菌株FX11 的形態(tài)與鏈霉菌屬Streptomyces 特征一致。

圖1 菌株FX11 對(duì)寄生水霉的拮抗作用Fig.1 Antagonistic activity of strain FX11 against S.parasitica

圖2 菌株FX11 的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of strain FX11

圖3 菌株FX11 的孢子絲(×1000)Fig.3 Spore hypha of strain FX11 (×1000)

圖4 菌株FX11 的分生孢子(×1000)Fig.4 Conidiospore of strain FX11 (×1000)

2.2.2 拮抗菌FX11 的16S rRNA 基因序列分析

以菌株FX11 的基因組DNA 為模板，1492R/27F為通用引物，經(jīng)PCR 擴(kuò)增、測(cè)序獲得長(zhǎng)度為1 183 bp的堿基序列(GenBank accession number：MN759326)。所測(cè)序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast 檢索，結(jié)果顯示該菌株與Streptomyces polychromogenes 的16S rRNA 基因序列相似性為98%。選取并下載典型菌株序列，以小單孢菌屬種類(lèi)Micromonospora viridifaciens為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果如圖5 所示，菌株FX11 與Streptomyces polychromogenes 聚類(lèi)在一個(gè)分支上，結(jié)合其形態(tài)結(jié)構(gòu)特征的初步鑒定結(jié)果，菌株FX11 鑒定為Streptomyces polychromogenes。

圖5 基于菌株FX11 的16S rRNA 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence of strain FX11 and related species

2.3 拮抗菌FX11 的安全性測(cè)定

拮抗菌FX11 的發(fā)酵濾液與散鱗鏡鯉、彭澤鯽、大鱗副泥鰍稚魚(yú)共同培養(yǎng)7 d 后，統(tǒng)計(jì)存活率。結(jié)果顯示，3 種稚魚(yú)的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組存活率均無(wú)顯著差異(P>0.05)，可見(jiàn)拮抗菌FX11 的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)試驗(yàn)用魚(yú)沒(méi)有毒性，具有良好的安全性，見(jiàn)圖6。

圖6 菌株FX11 的發(fā)酵濾液對(duì)試驗(yàn)用魚(yú)存活率的影響Fig.6 Effects of fermentation filtrate of strain FX11 on survival rate

2.4 拮抗菌傳代穩(wěn)定性測(cè)定

拮抗菌株FX11 和其傳代菌株分別與寄生水霉進(jìn)行平板對(duì)峙培養(yǎng)，結(jié)果見(jiàn)表1，拮抗菌FX11 繼代培養(yǎng)菌株與出發(fā)菌株之間抑菌效果差異不顯著(P>0.05)，可見(jiàn)該拮抗菌抑菌效果傳代穩(wěn)定。

表1 FX11 及其繼代培養(yǎng)菌株對(duì)寄生水霉的抑制作用Tab.1 Inhibitory effect of FX11 and its subculture strains on S.parasitica

2.5 溫度變化對(duì)拮抗菌發(fā)酵液抑菌活性的影響

溫度變化對(duì)菌株FX11 發(fā)酵液抑菌穩(wěn)定性的影響結(jié)果見(jiàn)圖7，10～70 ℃范圍內(nèi)處理的樣品其抑菌活性無(wú)顯著性差異(P>0.05)，表明溫度變化對(duì)菌株FX11 發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)的活性沒(méi)有影響，該菌株發(fā)酵液對(duì)溫度變化具有良好的耐受性。

2.6 拮抗菌發(fā)酵液酸堿穩(wěn)定性

pH 變化對(duì)FX11 發(fā)酵液抑菌活性的影響結(jié)果見(jiàn)圖8，試驗(yàn)菌株發(fā)酵濾液的抑菌活性對(duì)酸堿度變化較為敏感，pH 值低于6.0 或高于8.0，抑菌率顯著下降，僅在Ph 6.0～8.0 范圍內(nèi)抑菌活性較為穩(wěn)定，表明菌株FX11 發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)的活性受pH 影響較大，在pH 6.0～8.0 范圍內(nèi)抑菌作用穩(wěn)定。

圖7 不同溫度處理對(duì)拮抗菌FX11 發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.7 Effects of different temperature treatments on antibacterial activity of FX11 fermentation broth

圖8 不同酸堿度處理對(duì)拮抗菌FX11 發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.8 Effects of different pH treatments on antibacterial activity of FX11 fermentation broth

3 討論

以化學(xué)藥物、抗生素、疫苗及中草藥等方法防治水霉病存在各自的缺點(diǎn)和不足。利用拮抗菌及其發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)水霉病進(jìn)行防治具有綠色、環(huán)保、安全、高效的優(yōu)點(diǎn)，已成為水霉病防控研究的主流方向[3]。研究表明，一些細(xì)菌如芽孢桿菌Bacillus 和放線(xiàn)菌Actinomyces 對(duì)水霉菌具有良好的抑制作用。張書(shū)俊等[21]篩選獲得一株對(duì)水霉菌菌絲體生長(zhǎng)與孢子萌發(fā)具有明顯抑制作用的粘質(zhì)沙雷氏菌Serratia marcescens 菌株LD038。賀鳳等[22]從海底沉積物中分離、篩選水霉拮抗菌株海洋鏈霉菌Streptomyces sp.S26，其產(chǎn)生的活性物質(zhì)對(duì)病原水霉真菌有較強(qiáng)的抑制作用，并對(duì)外界環(huán)境變化有較強(qiáng)的適應(yīng)能力。梁永增、申慧等等[23-24]篩選的芽孢桿菌Bacillus sp.菌株JL04 和短小芽孢桿菌Bacillus pumilus JL50 對(duì)水霉菌均具有顯著抑制作用，2 株拮抗菌對(duì)魚(yú)體沒(méi)有毒性，且傳代穩(wěn)定。本研究從實(shí)驗(yàn)室分離保存的21 株放線(xiàn)菌中篩選獲得一株對(duì)寄生水霉具有顯著拮抗作用的鏈霉菌菌株FX11，試驗(yàn)結(jié)果表明該菌株對(duì)不同來(lái)源的多株寄生水霉均顯示出明顯的抑制作用。經(jīng)過(guò)對(duì)其形態(tài)學(xué)特征及16S rRNA 基因序列比對(duì)分析，可知菌株FX11 為鏈霉菌屬Streptomyces polychromogenes。該結(jié)果是Streptomyces polychromogenes 對(duì)水霉菌具有拮抗作用的首次報(bào)道。

Streptomyces polychromogenes FX11 的發(fā)酵濾液對(duì)供試稚魚(yú)無(wú)毒性。該菌株經(jīng)傳代培養(yǎng)后，對(duì)水霉菌拮抗作用穩(wěn)定，表明其具有良好的傳代穩(wěn)定性。該菌發(fā)酵濾液經(jīng)10～70 ℃低溫及高溫處理后，抑菌活性穩(wěn)定。淡水養(yǎng)殖水體的溫度變化范圍一般為0～34.6 ℃[25]，試驗(yàn)表明菌株FX11 發(fā)酵產(chǎn)物表現(xiàn)出對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境溫度變化的良好適應(yīng)性。該菌的發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性對(duì)環(huán)境的pH 波動(dòng)較為敏感，僅在pH 6～8 范圍內(nèi)具有顯著的抑菌效果。一般來(lái)說(shuō)，淡水養(yǎng)殖水體的pH 變化范圍為6.8～8.5[26]，可見(jiàn)該菌的發(fā)酵產(chǎn)物在淡水養(yǎng)殖水體中應(yīng)用具有較好的酸堿適應(yīng)性。本次試驗(yàn)為進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)水霉病生防菌劑提供了優(yōu)質(zhì)菌種資源和基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)，后續(xù)試驗(yàn)還將對(duì)該菌株的防治效果進(jìn)行測(cè)定，以期為該菌開(kāi)發(fā)為新型生物菌劑奠定基礎(chǔ)。