姚亞亞 劉陽星月 李宇凡 苗字葉 劉 壯 李慧靜

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院1，保定 071001) (北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心；北京工商大學(xué)2，北京 100048)

小麥過敏主要是指由小麥致敏蛋白引起的Ⅰ型超敏反應(yīng)[1，2]。在研究小麥蛋白致敏機(jī)理、檢測方法的建立以及脫敏方法篩選中，關(guān)鍵是了解小麥過敏原。小麥蛋白種類繁多，其中小麥致敏蛋白占大部分，根據(jù)世界衛(wèi)生組織和國際免疫學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)(WHO/IUIS)過敏原命名小組委員，截止到2016年11月29日已批準(zhǔn)13種食源性小麥過敏原[3]，包括抑制蛋白、非特異性脂轉(zhuǎn)換蛋白、同工麥胚凝集素、ω5-醇溶蛋白、α淀粉酶CM17、硫氧還蛋白、高分子量麥谷蛋白、低分子質(zhì)量谷蛋白G1uB3-23、Y-醇溶蛋白、α-嘌呤硫素、線粒體NFKB1的泛素連接酶原激活劑、假定小麥蛋白、胚乳傳遞細(xì)胞特異性PR60前體、延伸因子1，其致敏亞基分子質(zhì)量分布為9.5、12、13、16、17、20、26、27、32～38、39.5、65、83、88 ku的蛋白[4，5]。

目前，國外對(duì)小麥過敏原的鑒定開展了大量的研究。Sander等[6]以10名小麥致敏面包師患者血清為樣本，其檢測出IgE的主要結(jié)合蛋白亞基分子量為40、42、26 ku的蛋白。Weiss等[7]通過SDS-PAGE和免疫印跡證明20名對(duì)小麥粉過敏患者的血清含有與70、55、35、26～28、14～18 ku區(qū)域中的許多白蛋白/球蛋白多肽結(jié)合的IgE抗體。Venter等[8]在對(duì)小麥致敏的37名兒童檢測中，3名(8.1%)對(duì)ω5-醇溶蛋白敏感，1名(2.7%)對(duì)小麥脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白敏感，1名(2.7%)對(duì)麥小麥醇溶蛋白敏感。Nilsson等[9]對(duì)63名被醫(yī)生診斷為患有小麥過敏癥的兒童進(jìn)行致敏組分分析，其中ω-5麥醇溶蛋白，低分子量谷蛋白(LMW-glutenin)和高分子量谷蛋白(HMW-glutenin)以及天然麥醇溶蛋白四種小麥蛋白組分的免疫球蛋白E抗體(IgE-ab)水平顯著較高(P<0.000 1)。

我國對(duì)小麥過敏原的鑒定方面鮮有報(bào)道，對(duì)引起我國小麥過敏患者過敏的主要過敏原致敏概率的研究還處于起步階段。朱奕锜等[10]通過檢測分析10例患有WDEIA的小麥過敏患者，結(jié)果顯示患者對(duì)3-磷酸甘油醛脫氫酶過敏，對(duì)三聚淀粉酶抑制劑、ω-5醇溶和磷酸丙糖異構(gòu)酶等蛋白敏感。冼靜雯等[11]通過分離小麥過敏原和免疫印跡方法對(duì)小麥過敏原免疫學(xué)特性進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明23 ku蛋白為主要的小麥過敏原。

師欒02-1小麥作為小麥主產(chǎn)區(qū)主要品種，且其等級(jí)達(dá)到國標(biāo)一等，具有良好的烘焙等加工品質(zhì)[12]，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇師欒02-1小麥品種做過敏原分析。以我國12例小麥過敏患者的血清為探針，3例正常人的血清池為對(duì)照，與師欒02-1小麥粉進(jìn)行電泳免疫印跡分析鑒定，引起我國小麥過敏人群過敏的小麥過敏原及其致敏概率，以期發(fā)現(xiàn)新的小麥過敏原，為后期建立適合引起我國小麥過敏人群過敏的主要過敏原檢測技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

師欒02-1小麥(蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14.93%)，精細(xì)加工成小麥粉；小麥過敏患者血清由中國解放軍白求恩國際和平醫(yī)院和北京軍區(qū)總醫(yī)院提供；小麥正常者血清由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)校醫(yī)院提供；丙烯酰胺(Acr)；甲叉丙烯酰胺(Bis)；過硫酸銨(AP)；十二烷基磺酸鈉(SDS)；四甲基乙二胺(TEMED)；巰基乙醇；三羥甲基氨基甲烷(Tris)；考馬斯亮藍(lán)(R-250)；牛血清白蛋白(BSA)；標(biāo)準(zhǔn)蛋白；34079型ECL試劑盒；聚偏氟乙烯(PVDF)膜；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器和設(shè)備

ImmunoCAP 250全自動(dòng)體外免疫檢測系統(tǒng)；ZNCL-S140X140磁力攪拌器；PHS-3C型PH計(jì)；DYCZ-28A型單板夾芯式垂直電泳儀；Multiskan FC型酶標(biāo)儀；凝膠成像儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

采用正己烷脫脂，小麥粉與正己烷按照1∶2的質(zhì)量體積比例混合，在密閉容器中用攪拌器攪拌4 h后靜置0.5 h，然后將上層黃色液體倒出，之后再按小麥粉∶正己烷1∶2加正己烷，攪拌2 h后靜置0.5 h，倒出上層黃色液體，重復(fù)操作，直到上層液呈無色為止。放置于通風(fēng)櫥干燥。將去脂小麥粉樣品按照1∶20的質(zhì)量體積比例加入樣品緩沖液，提取24 h，于室溫下4 000×g離心20 min，留其上清液，舍棄沉淀，再在10 000×g室溫下離心15 min去除殘存的脂肪和不溶性微粒。采用Bradford法測定上清液蛋白質(zhì)濃度，并將在-20 ℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

采用不連續(xù)SDS-PAGE垂直電泳，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%。將所制備樣品于室溫下融化，沸水浴加熱5 min，樣品上樣量為10 μg，電壓待樣品進(jìn)入分離膠時(shí)，將電壓調(diào)至160 V，待染料前沿遷移至橡膠框底邊1 cm處，停止電泳。取下凝膠，將凝膠于固定液中固定2 h，傾去固定液，置于考馬斯亮藍(lán)(R-250)染色液染色2～5 h，傾去染色液，加入脫色液，幾小時(shí)更換一次脫色液，直到凝膠的藍(lán)色背景完全褪去，蛋白質(zhì)的電泳條帶清晰為止。量出溴酚藍(lán)區(qū)帶中心距加樣端的距離(cm)和各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心與加樣端的距離(cm)，計(jì)算蛋白質(zhì)樣品相對(duì)遷移率(mR)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線為：

y=-0.717 4x+1.368 6，R2=0.997 5。

1.3.3 小麥過敏患者血清中小麥特異性IgE(sIgE)的測定

ImmunoCap 250全自動(dòng)體外免疫檢測系統(tǒng)測定小麥過敏患者血清中小麥特異性免疫蛋白，判定標(biāo)準(zhǔn)如表1，小麥過敏患者血清在-80 ℃凍存，使用前復(fù)融。

表1 國際上sIgE含量過敏定級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

1.3.4 小麥非過敏患者與小麥粉的免疫印跡(Western-Blotting)

以3例正常人的血清和血清池為樣本，采用免疫印跡技術(shù)進(jìn)行免疫學(xué)特性分析鑒定小麥粉中存在的小麥非過敏原。首先采用不連續(xù)SDS-PAGE垂直電泳，分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%，進(jìn)行電泳，電泳后再將膠放入電轉(zhuǎn)液浸泡30 min，電轉(zhuǎn)時(shí)，按照墊片、濾紙、PVDF膜、膠、濾紙、墊片的順序組裝在一起，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；將PVDF膜放置于30%BSA中封閉60 min；之后進(jìn)行洗膜，用1×TBST溶液洗滌5次，每次3 min；用3%BSA將血清按照1∶400的比例進(jìn)行稀釋，加入血清，37 ℃孵育2 h；同上洗膜，用1×TBST溶液洗滌5次，每次3 min；再加入用3%BSA將血清按照1∶5 000的比例進(jìn)行稀釋的二抗，置于搖床上37 ℃孵育1 h，同上洗膜5次后將ECL試劑盒中A液和B液按照1∶1比例混合取1 mL置于PVDF膜上；顯影、定影后攝像分析相對(duì)分子質(zhì)量。

1.3.5 小麥過敏患者與小麥粉的免疫印跡(Western blotting)

世界衛(wèi)生組織和國際免疫學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)(WHO/IUIS)過敏原命名小組委員要求能夠加入過敏原的官方列表標(biāo)準(zhǔn)為至少需要5例過敏患者血清[3]。采用免疫印跡技術(shù)對(duì)12例小麥過敏患者血清與小麥粉蛋白進(jìn)行免疫學(xué)特性分析鑒定小麥粉中存在的小麥過敏原。其余步驟同1.3.4。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥粉SDS-PAGE

小麥粉SDS-PAGE圖譜(圖1)結(jié)果表明小麥粉含有豐富的蛋白亞基，其主要亞基分子量分布為117、97、83、72、69、64、62、58、54、43、40、37、27、26、25、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12 ku，其條帶的深淺代表亞基含量的高低。Akagawa等[13]利用SDS-PAGE分析了小麥粉中的全蛋白亞基分布，其亞基分布與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。小麥粉中蛋白含量豐富，是人們獲取蛋白營養(yǎng)物質(zhì)的主要來源，但其蛋白可能為潛在的過敏原，對(duì)小麥過敏患者產(chǎn)生健康危害。因此，明確具體的過敏原，鑒定致敏概率是為建立適合引起我國小麥過敏人群過敏的主要過敏原檢測技術(shù)提供參考。

圖1 小麥粉SDS-PAGE圖譜

2.2 小麥過敏患者sIgE水平

由表2可知，在12例小麥過敏患者中，大部分患者屬于陽性等級(jí)，占91.7%，弱陽性占8.3%。朱奕锜等[10]針對(duì)10名患有小麥依賴-運(yùn)動(dòng)誘發(fā)過敏反應(yīng)(WDEIA)進(jìn)行小麥過敏原sIgE檢測，檢測結(jié)果顯示，50%患者為陽性，10%為強(qiáng)陽性，30%為弱陽性，與本結(jié)果幾乎一致。尹佳等[14]測定了15例WDEIA患者的sIgE，結(jié)果同樣表明大部分患者為陽性等級(jí)，其比例達(dá)到86.7%。Lee等[15]通過ImmunoCAP分析了6例小麥過敏患者血清sIgE，結(jié)果表明6例患者中33.3%屬弱陽性范圍，66.7%屬陽性等級(jí)。與本結(jié)果基本一致，因此本實(shí)驗(yàn)所選擇的12例血清具有代表性，可進(jìn)行進(jìn)一步分析。

表2 小麥過敏患者sIgE水平

2.3 小麥粉非過敏患者血清免疫印跡圖譜分析

由于過敏原的識(shí)別存在非特異性吸附造成結(jié)果為假陽性，盡管在實(shí)驗(yàn)過程中加入牛血清白蛋白作為封閉液消除，但人的血清樣本中會(huì)存在一些非特異性干擾物質(zhì)，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果[16，17]。因此，首先要排除過敏原假陽性結(jié)果，為后期過敏患者血清免疫印跡結(jié)果的可靠性，選擇3例非過敏患者血清的血清池作為陰性對(duì)照，由圖2可知，3例正常血清池免疫結(jié)果表明分子量49、42、39 ku亞基為非過敏原。

圖2 小麥粉與小麥非過敏患者血清池反應(yīng)的免疫印跡圖

2.4 小麥粉過敏患者血清免疫印跡圖譜分析

注：1～10分別為10、15、25、35、40、55、70、100、130、170 ku。圖3 小麥粉與小麥過敏患者血清反應(yīng)的免疫印跡圖

以我國12例小麥過敏患者的血清和血清池樣本為探針，3例正常人的血清和血清池樣本為對(duì)照，進(jìn)行小麥過敏者血清與還原態(tài)一維電泳分離的小麥粉的免疫印跡反應(yīng)，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明引起我國小麥過敏患者過敏的小麥過敏原包括288、230、207、193、188、166、156、135、134、125、118、113、112、109、106、103、101、100、94、83、81、79、75、73、72、69、68、67、66、63、62、60、58、57、56、54、52、50、49、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10 ku等亞基；這些亞基致敏概率自高至低依次為17 ku(6/12)、28 ku(6/12)、14 ku(5/12)、19 ku(5/12)、22 ku(5/12)、24 ku(5/12)、25 ku(5/12)、26 ku(5/12)、11 ku(4/12)、12 ku(4/12)、16 ku(4/12)、21 ku(4/12)、27 ku(4/12)、18 ku(3/12)、30 ku(3/12)、31 ku(3/12)、36 ku(3/12)、47 ku(3/12)、83 ku(3/12)，其他亞基致敏概率為1/6或1/12。

用12種不同血清獲得的IgE免疫印跡在識(shí)別的過敏原中顯示顯著的差異性，每名小麥粉患者表現(xiàn)出不同過敏原斑點(diǎn)的個(gè)體敏化模式(表3)。對(duì)于大多數(shù)過敏原來源，針對(duì)不同個(gè)體建立的IgE結(jié)合模式在常見或主要過敏原存在的基礎(chǔ)上非常相似，偶爾存在罕見或次要過敏原，抗體應(yīng)答的個(gè)體差異可能是由于患者的傾向或單變應(yīng)原的可變暴露水平[18]。Sander等[6]以10名小麥致敏面包師患者血清，通過二維電泳免疫印跡分析，結(jié)果顯示，10種不同血清獲得的IgE免疫印跡呈現(xiàn)顯著的差異性，每位患者都顯示出一種單獨(dú)的IgE結(jié)合模式，其中有4至50種不同的過敏原斑點(diǎn)，總共檢測到100多種IgE結(jié)合蛋白斑點(diǎn)，其檢測出IgE的主要結(jié)合蛋白亞基分子量為40、42、26 ku的蛋白，與本實(shí)驗(yàn)所鑒定42 kD為非特異性免疫蛋白存在差異，此差異可能源于不同個(gè)體人群免疫水平的差異。Weiss等[7]通過SDS-PAGE和免疫印跡證明20名對(duì)小麥粉過敏患者的血清含有與70、55、35、26～28、14～18ku區(qū)域中的許多白蛋白/球蛋白多肽結(jié)合的IgE抗體，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果除了70、55 ku，其余致敏亞基與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，該差異可能由于所用血清樣本及所選小麥品種不同。

表3 小麥粉與小麥過敏者血清的免疫印跡圖致敏亞基分子質(zhì)量分析結(jié)果/ku

注：每列序號(hào)與免疫印跡圖3序號(hào)一致。

3 結(jié)論

以我國12例小麥過敏患者的血清為探針，3例正常人的血清池為對(duì)照，與師欒02-1小麥粉進(jìn)行還原態(tài)一維電泳免疫印跡分析鑒定引起我國小麥過敏人群過敏的小麥過敏原及其致敏概率。鑒定結(jié)果表明，小麥過敏原蛋白亞基的致敏概率自高至低的順序依次為17 ku(6/12)、28 ku(6/12)、14 ku(5/12)、19 ku(5/12)、22 ku(5/12)、24 ku(5/12)、25 ku(5/12)、26 ku(5/12)、11 ku(4/12)、12 ku(4/12)、16 ku(4/12)、21 ku(4/12)、27 ku(4/12)、18 ku(3/12)、30 ku(3/12)、31 ku(3/12)、36 ku(3/12)、47 ku(3/12)、83 ku(3/12)，其他亞基致敏概率為1/6或1/12。

目前，市場上過敏原檢測試劑盒主要為進(jìn)口試劑盒，國內(nèi)公司試劑盒的研制大多是基于引起外國人群過敏的小麥過敏原進(jìn)行開發(fā)。然而，本研究結(jié)果表明不同人群過敏原分布差距較大，故急需開發(fā)適合我國小麥過敏人群得檢測方法。本研究為建立適合引起我國小麥過敏人群過敏的主要過敏原檢測方法提供了借鑒。